吴如慧　李增平　孙先伊晴　张宇　丁婧钰　程乐乐

摘 要 利用海南省橡胶树臭根病病株上采集的病根样本，采用菌索组织分离法获得菌落后，进行子实体诱导产生分生孢子，再经单孢分离纯化获得菌株HNDZ001，通过柯赫氏法则验证、形态学特征观察及分子生物学技术对该菌株进行鉴定，确定菌株HNDZ001为引起橡胶树臭根病的匐灿球赤壳菌（Sphaerostilbe repens Berk.& Br.）。生物学特性测定结果表明，菌株HNDZ001在PDA培养基上菌落近圆形，表面黄白色，致密，背面呈深褐色至浅黄色，后期会产生黄褐色菌索和孢梗束；该菌菌丝生长的适宜条件为温度25～34 ℃、pH 7～9，最适生长条件是温度28 ℃、pH值为8、甘露醇为碳源、牛肉浸膏为氮源、完全黑暗，且在黄瓜汁培养基上菌丝生长最好。

关键词 橡胶树；臭根病；匐灿球赤壳菌；生物学特性

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Utilizing the diseased root samples collected from the stinking root rot of rubber tree in Hainan Province， colonies were obtained using the method of rhizomorph tissue isolation， and then the sporocarp was induced to produce conidia. The strain HNDZ001 was obtained by single spore isolation and purification. Based on the Kochs postulates， morphological characteristics and molecular biological technology， the strain HNDZ001 was identified as Sphaerostilbe repens Berk. & Br.， and It was the pathogen causing stinking root rot of rubber tree. The biological characteristics of the strain showed that the colonies were nearly round， yellowish-white and dense on the surface， dark brown to light yellow on the back， and produced yellow brown rhizomorph synnema on the PDA medium； The optimum conditions for mycelium growth were 25-34 ℃， pH 7-9. The optimum growth conditions were 28 ℃， pH 8， mannitol as carbon source， beef extract as nitrogen source， completely dark， and mycelium grew best in cucumber juice agar medium.

Key words rubber tree； stinking root rot； Sphaerostilbe repens； biological characteristic

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.017

橡膠树根病是影响橡胶树生长和减产的三大重要病害之一，目前对于进行橡胶树根病的经济有效防治还是一大难题[1]。国外报道的橡胶树根病有8种，我国已发现7种，为害较大的有红根病、褐根病、臭根病，此外还有紫根病、白根病、黑纹根病、黑根病。1907年首次在锡兰的胶树上发现臭根病[2]。臭根病于低洼积水的胶园易发生，是一种仅次于褐根病而导致胶树死亡最快的根病。臭根病因病根会散发出恶臭而得名，但这种臭气是由于在潮湿条件下繁殖起来的细菌使病根腐败而产生，仅臭根病菌为害则不会产生臭气[2]。发病的橡胶树剥下病根表皮后，在木质部的表面和根皮内侧都能看到明显的白色草叶状菌索，老化的菌索部分转为红棕色或巧克力色，后期全部变为黑色[3]。水淹、机械损伤或毒杀后的胶树树根，都易受臭根病菌的侵染，胶树染病后，病菌靠根状菌索生长到邻近胶树的根系进行蔓延扩展，不断加重为害[4]。近年来，在海南、云南种植区的橡胶树臭根病发生有逐年增多的趋势，且笔者在海南还发现木菠萝、龙眼、榕树等木本植物也有发生臭根病。对橡胶树臭根病菌的分离和生物学特性在国内外尚未见有详细的研究报道。为了弄清橡胶树臭根病病菌的侵染过程和发病规律，本文从海南省儋州两院发生臭根病的橡胶树病根上取样，成功分离纯化出病原菌后进行了生物学特性测定，旨在为进一步深入研究该病菌和生产防治臭根病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病样及接种苗木 于2016年11月从海南省儋州市两院试验农场沙田队橡胶园采集带有白色草叶状菌索的病根，所采样本用保鲜袋包装后带回实验室备用。接种所用橡胶苗为海南大学热带农林学院学生教学基地内种植的2年生苗木。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、马铃薯蔗糖琼脂（potato sugar agar，PSA）培养基、马铃薯胡萝卜琼脂（potato carrot agar，PCA）培养基、查彼（Czapek）培养基、燕麦片琼脂（oat meal agar，OMA）培养基、玉米粉琼脂（corn meal agar，CMA）培养基、黄瓜汁（cucumber juice agar，CJA）培养基：黄瓜200 g、琼脂粉11 g、蒸馏水 1 L；橡胶根汁培养基：橡胶根200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉11 g、蒸馏水1 L；橡胶茎汁培养基：橡胶茎200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉11 g、蒸馏水1 L。参阅方中达[5]《植病研究方法》和孙广宇[6]《植物病理学实验技术》配制。

1.1.3 试剂及仪器 E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit、E.Z.N.A. Gel Extraction Kit（100），美国OMEGA公司；2×Taq-Mixture，北京Biomed公司；DNA Marker，大连TaKaRa公司；Olympus BX 51显微镜，日本Olympus公司；JY600电泳仪，上海京工实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 橡胶树臭根病病原菌分离纯化 菌索组织分离法：从发病的病根表皮内侧切取约5 mm长的白色草叶状菌索，在75%乙醇溶液中浸泡6～8 s，再用1%的升汞溶液浸泡1 min，然后用灭菌水冲洗4次，用无菌吸水纸吸干，接种到PDA培养基平板上，于28 ℃恒温培养，待长出菌丝后进行纯化，转入新的PDA培养基平板上保存备用。

单孢分离法：待分离菌在PDA培养基平板上长出根状菌索和孢梗束后，用灭菌的接种环从孢梗束顶端的乳白色分生孢子球上挑取少量分生孢子，置于1 mL灭菌水中混匀后，进行3次梯度稀释成不同浓度的孢子悬浮液，用灭菌的玻璃涂棒分别粘取不同稀释度的孢子悬浮液涂布在PDA培养基平板表面，28 ℃恒温培养1 d后挑取单孢菌落进行纯化，获得的纯化菌株编号为HNDZ001。

1.2.2 菌株的致病性测定 离体接种取6段直径约1.5 cm粗，8～20 cm长的黄白色新鲜橡胶树健康根段，4段根接分离菌，两段根接空白PDA培养基作对照；活体接种选取6株龄期为1年生的热研7-33-97健康橡胶树袋装苗，3株接HNDZ001分离菌，3株接空白PDA培养基作对照。先在待接种植株的茎干基部或根段表面喷70%酒精进行消毒，待酒精风干后用灭菌手术刀在消毒的植株茎干表面间隔5 cm左右削出2～3个长约1 cm的平面伤口，用无菌接种环挑取带根状菌索的菌丝块，菌丝面朝下接种在伤口上，表面覆盖无菌水湿润的棉花后包裹保湿，每2 d观察一次，定期记录发病情况并拍照。

1.2.3 菌株的鉴定 形态鉴定：将分离菌株接种在PDA培养基上，28 ℃培养12 d后，观察菌落形态，并在光学显微镜下观察和测量病菌的孢梗束和分生孢子并拍照。分子鉴定：菌株培养12 d后收集100 mg菌丝，使用OMEGA Fungal DNA Kit来提取DNA。采用通用引物 ITS1（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对所提取DNA的rDNA-ITS 片段进行PCR扩增[7]，引物合成由华大基因（深圳）生物科技有限公司完成。扩增产物在恒压150 V下用1%琼脂糖凝胶电泳检测。使用OMEGA Extraction Kit试剂盒切胶回收目的片段，纯化后送华大基因（深圳）生物科技有限公司测序。将测序获得的ITS序列在NCBI上进行BLAST比对分析，并提交序列，利用MEGA 5.0软件以邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。

1.2.4 橡胶树臭根病病原菌的生物学特性测定 用直徑6 mm的打孔器在菌龄一致（12 d）的培养菌落边缘打取菌饼备用，分别将菌饼接到不同种类的培养基平板中心，观察菌落的生长情况。待最优条件下的菌丝生长到接近培养皿边缘时（约12 d后）取出，并用十字交叉法测量菌落直径。每组不同处理设置3个重复。

除不同培养基及碳、氮源生物学测定外，其他条件所使用的培养基均为CJA培养基。（1）培养基：选用橡胶根汁、橡胶茎汁、PDA、PCA、PSA、Czapek、OMA、CMA、CJA共9种不同培养基，接菌后置于28 ℃恒温黑暗培养。（2）温度：测定条件为10、15、20、25、26、28、30、32、34、36、38、40 ℃共12个梯度，接菌后置于不同温度下恒温黑暗培养。（3）光照：采用15 W照明灯，测定条件设置为24 h全光照、24 h全黑暗、12 h光照与12 h黑暗交替3种条件，28 ℃恒温培养。（4）pH值：用1 mol/L 的HCl和1 mol/L的NaOH溶液将已灭菌的CJA培养基的pH值分别调至3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13共11个梯度，3组重复接菌饼进行测定。（5）碳、氮源：分别称取等质量的葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、D-果糖、蔗糖、可溶性淀粉、α-乳糖、肌醇、丙三醇、甘露醇、D-山梨醇作为碳源；称取等质量的酵母浸膏、大豆蛋白胨、牛肉膏、草酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钙、硝酸钠、硝酸钾作为氮源；分别替换Czapek培养基中的碳、氮源，设3组重复接菌饼进行测定。将不加碳源、氮源的Czapek培养基作为缺碳、缺氮空白对照。

1.3 数据分析

利用Excel 2010和SAS 9.1软件进行数据统计分析，采用Duncants multiple range test进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 橡胶树臭根病症状和田间发病特点

发生臭根病的橡胶树初期整株叶片和嫩枝在短期内迅速失水、失绿萎垂，继而逐渐变褐，小枝干枯，叶片脱落后，大枝条和茎干继续失水，树皮干缩，1个多月后整株彻底枯死（图1-A～C）。发病初期的病根表皮呈灰褐色，不粘泥沙，用水较易洗掉，树干基部表皮和树根表皮组织水浸状湿腐，易与木质部分离，木质部表面与表皮内侧组织呈暗灰白色，散发出难闻的粪便臭味（图1-D）。条件适宜时在病根表面长有灰白色菌膜，紧贴表皮下的菌膜呈黄白色，木质部表面和表皮内侧长出扁而粗的白色羽毛状菌索，菌索增粗后联合成草叶状，后期草叶状菌索变成红褐色或黑褐色（图1-E～H）。

2.2 致病性测定

单孢分离纯化的橡胶树臭根病菌HNDZ001菌株在活体橡胶树根茎部接种12 d后能造成接种部位的茎干基部组织呈褐色，散发有臭味，并伴有孢梗束的产生，与田间自然发病的症状相似；对照皮下组织白色，未被侵染。带菌索的菌丝块接种在离体的橡胶树根段上5 d后，接种部位的橡胶根表变褐色，旁边长出孢梗束，对照无变化。切取接菌后发病的植物病部组织进行再分离，重新分离获得形态相同的菌株，表明用于接种的分离菌为致病菌（图2）。

2.3 橡胶树臭根病病菌形态

菌株HNDZ001在PDA培养基上生长的菌落呈圆形，菌落初期呈白色，继而变黄白色，菌丝致密，后期逐渐变为浅黄色，背面中央的颜色逐渐变为橘黄色（图3-a）。在PDA培养基上有时在菌落中伴随有褐色根状菌索的产生，根状菌索紧贴培养基匍匐生长，直径为2.0～3.5 mm，菌索先端呈明显的二叉状分枝，在根状菌索上长有直立生长的粉红色棍棒状孢梗束，后期变红褐色（图3-b）；孢梗束大小为（322.85～1 880.87） μm×（69.65～618.03） μm（平均650.97 μm×183.85 μm），孢梗束上部分生孢子梗分散呈花束状，众多分生孢子梗顶端产生的分生孢子和胶质物一起粘结形成球形或扁球形、乳白色、略透明的分生孢子球，内含大量分生孢子；孢子球大小为（175.20～601.08） μm×（190.70～850.17） μm（平均403.26 μm×409.70 μm）（图3-c～d）；分生孢子产生于分生孢子梗顶端，单胞，无色，卵圆形，两端略尖，内含1～2个油球；分生孢子大小为（10.7～22.8） μm×（4.4～9.4） μm（图3-e～f）。在菌丝上可产生大量黄褐色球形的厚垣孢子，大小为（10.24～14.94） μm×（9.354～14.55） μm（图3-g）。

2.4 橡胶树臭根病病原菌的分子鉴定

对病原菌进行ITS-PCR扩增，获得1条550 bp左右的清晰条带。测序显示该菌的rDNA-ITS片段大小为544 bp（MG230794），将该序列在NCBI上BLAST比对，选取巨孢赤壳菌（Cosmospora gigas）、Corallomycetella elegans、藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）等9株菌株，进行多重序列比较及系统发育学分析，结果显示该病原菌的rDNA-ITS序列与匐灿球赤壳菌（KM231828）的同源性达99%，表明该病原菌HNDZ001与匐灿球赤壳菌遗传距离最小，聚为一类（图4）。结合传统形态学鉴定与rDNA-ITS序列分析结果，将该病原菌鉴定为匐灿球赤壳菌[Sphaerostilbe repens Berk.&Br.= Corallomycetella elegans Berk. & Curt ]。

2.5 橡胶树臭根病病菌的生物学特性

2.5.1 培养基对菌丝生长的影响 橡胶树臭根病病菌HNDZ001在供试的9种培养基上均能生长，但只有PDA培养基可以诱导出根状菌索和孢梗束。在橡胶根汁、橡胶茎汁培养基上长势虽快但是菌落稀薄，菌丝絮状；在CJA、Czapek、CMA、PSA、PDA培养基上菌丝致密，长势很好，菌丝淡黄至黄褐色，除CJA培养基外，其他都有同心轮纹；在PCA和OMA培养基上长势一般，菌丝较稀薄，有同心轮纹，菌丝白色至淡黄色（图5）。表明CJA培养基最适合橡胶树臭根病病菌生长，而PDA培养基则可诱导出根状菌索和孢梗束（图3-b）。

2.5.2 pH对菌丝生长的影响 橡胶树臭根病病菌HNDZ001在pH4～13范围内菌丝均能生长，pH 4时生长缓慢，pH 5～8时菌丝生长速率增快，pH 8时菌落直径极显著高于其它处理，表明pH8最适宜菌丝生长，pH 8～13与pH 4处理间菌落直径差异显著（图6），表明橡胶树臭根病病菌在中性至碱性环境中生长要比在酸性环境中好。

2.5.3 光照对菌丝生长的影响 橡胶树臭根病病菌HNDZ001在连续光照、12 h光暗交替、完全黑暗3种光照条件下均能生长，但3种处理下菌丝生长状况差异比较明显，完全黑暗条件下病原菌菌丝生长速度最快，连续光照条件下菌丝生长速度最慢。由此可见，光照对橡胶树臭根病病菌的菌丝生长有抑制作用（图7）。

2.5.4 温度对菌丝生长的影响 橡胶树臭根病病菌HNDZ001在15～38 ℃温度范围内均能生长，40 ℃停止生长，但病原菌未死亡，将其转移至合适温度仍可继续生长；适宜的生长温度为25～32 ℃，最适生长温度为28 ℃（图8）。

2.5.5 碳、氮源对菌丝生长的影响 从表1可知，橡胶树臭根病病菌菌丝对不同的碳源或者不同种类的同类型碳源的利用率存在差异。橡胶树臭根病病菌HNDZ001在供试的12种碳源培养基上均能生长，其中在以甘露醇为碳源的菌落直径最大，菌丝致密，絮状，深褐色，其次为肌醇、D-山梨醇和甘油，在D-木糖和葡萄糖中菌落直径最小，且在D-木糖中菌落稀薄，碳源的利用率低。

从表2可知，病原菌对不同的氮源利用率存在差异。橡胶树臭根病病菌HNDZ001在供试的11种氮源培养基上均能生长，单一氮源以硝酸钙为氮源的菌落直径最大，其次为硝酸钠。草酸铵为氮源的菌落直径最小。在缺氮元素的培养基中，虽然菌落直径最大，但是菌丝稀薄，几乎近透明状。复合氮源中牛肉浸膏菌落直径最大，菌落圆形，中央深褐色，边缘淡黄色，致密，有同心轮纹。

3 讨论

海南橡胶树臭根病在田间主要发生于7～9月间的多雨季节，在胶园中低洼易积水处的胶树易发病，被土掩埋过深或近沟边被水浸泡根系的胶树也易发病，有单株发病，死亡后不再传播扩展，也有单株发病后通过土壤中病根上的菌膜和菌索蔓延到邻近胶树上的根系上侵染而扩展形成3～7株染病后枯死的较大病区，但不会像红根病或褐根病形成几十株甚至百株以上的大病区。

本研究发现臭根病菌形态特征与报道的匐灿球赤壳菌（Sphaerostilbe repens）相同[8]。已有报道匐灿球赤壳菌（Sphaerostilbe repens B.etBr.=Corallomyces elegans Berk.&Curt=Corallomycetella elegans Berk.&Curt）[9-13]是引起中非的大部分地区（尤其是刚果）木薯白根病害的主要病原菌。该病最早在斯里兰卡的番木瓜上首次报道，随后发现在马来西亚的柑橘、木槿、芒果、木薯和鳄梨上均有发生；在非洲，乌干达、科特迪瓦、加纳和扎伊尔的橡膠树上均发现该病害[14]；在刚果，匐灿球赤壳菌也会侵染甘薯的块茎并造成严重的经济损失[15]。孢梗束和根状菌索紧密结合在一起形成一个聚合体，这个聚合体在匐灿球赤壳菌的侵染过程中发挥重要的作用[16]。本研究利用橡胶树臭根病新鲜病根上产生的菌索进行分离，在PDA培养基上形成菌索、孢梗束和分生孢子孢囊束和分生孢子梗后进行单孢分离纯化，结果显示橡胶树臭根病病原菌在黑暗条件下有利于其生长，光照对其生长存在抑制作用；黄瓜汁培养基最适合该菌生长；该菌菌丝生长适宜温度25～34 ℃，最适温度28 ℃；适宜的pH值范围7～9，pH8时最适菌丝生长；以甘露醇为碳源的菌落长势最好；单一氮源以硝酸钙为氮源的菌落长势最好，复合氮源以牛肉浸膏为氮源长势最好。研究表明，橡胶树臭根病在田间可由气流传播分生孢子从根茎伤口处侵入引起发病，条件适宜时，发病植株也可由病根上产生的菌膜和菌索蔓延到健根上扩展传播为害邻近胶树，形成小病区。防止橡胶树头长期积水可减少此病的发生。

对于橡胶树臭根病，尽管在世界很多植胶国家都有发生，但是相关研究较少，对病原菌的鉴定、生物学特性以及病害的发生发展规律等内容的研究尚不够全面，在我国也未见相关报道。本研究首次采用菌索组织分离法获得纯化菌落后，进行子实体诱导产生分生孢子，再经单孢分离纯化获得单孢菌株，并进行了相关生物学特性和致病性测定，完成了柯赫法则验证，补充了这一方面的研究空白。今后可进一步深入开展臭根病菌的有性态的诱导及发病规律等相关研究。

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