兰玉菲+唐丽娜+李秀梅+王庆武

摘 要：采用组织分离的方法从野生侧耳属菌株（Pleurotu ssp.）子实体上分离得到菌株XZG-ts，以其基因组为模板扩增获得该菌株的ITS序列，序列分析结果表明，菌株XZG-ts与GenBank中来自于澳大利亚、印度和中国云南的3个肺形侧耳菌株聚为一簇，组内核苷酸一致率为100%，而与侧耳属其他4个种的10个菌株核苷酸一致率为98.10%～99.06%，依此结果将XZG-ts菌株鉴定为P. pulmonarius。进一步研究了不同碳源、氮源、碳氮组合、温度及pH值对菌株XZG-ts菌丝生长的影响，结果表明，最适碳源为果糖，氮源为酵母膏，最佳碳氮源组合为果糖1%、麦芽糖1.0%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.3%，最适生长温度为25℃，最适pH值为6。

关键词：侧耳属菌株；ITS序列分析；生物学特性；肺形侧耳

中图分类号：S646.9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）12-0091-04

Abstract A fungi strain， XZG-ts， collected from the Mountain Tai， was isolated by tissue isolation and the internal transcribed spacers （ITS） was amplified by PCR. In the phylogenetic tree constructed with ITS， XZG-ts formed a branch with 3 isolates belonging to Pleurotus pulmonarius from Australian， India and China with the consistent rate of 100% in intra-group nucleotide. While it was only 98.10%～99.06% with other 10 isolates of Pleurotus. Therefore XZG-ts was identified as P. pulmonarius. The effects of carbon source， nitrogen source， carbon-nitrogen combination and pH value on the growth of mycelium were further studied. The results showed the optimum carbon source， nitrogen source， temperature and pH value was fructose， yeast extract， 25℃ and 6， respectively. And the optimum carbon-nitrogen combination was 1% fructose， 1.0% maltose， 0.2% yeast extract， 0.3% peptone.

Keywords Pleurotus sp.； ITS sequence analysis； Biological characteristic； Pleurotus pulmonarius

侧耳属[Pleurotus （Fr.） P. Kumm.]是与人类关系密切的重要经济真菌，世界广泛存在20 种[1]，对木质纤维素的转化以及环境修复作用倍受关注[2]。近200年来，侧耳属描述的分类单元超过1 000 个[3]，主要原因是子实体形态受环境条件影响大，按照形态特征分类导致较多的同物异名或同名异物。我国侧耳属真菌野生资源丰富，分布范围也极其广泛。本研究从泰山分离获得一株野生侧耳属菌株，对其进行鉴定，并研究明确了该菌株菌丝体最适培养条件，为产业发展和教学科研提供了新的种质资源，同时为进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

将采自泰山的野生侧耳属菌株参照文献[4]进行组织分离、纯化，标为XZG-ts。

1.2 主要试剂

真菌总DNA提取试剂盒（E.Z.N.A. Fungal DNA Kit），购自北京全式金公司；PCR所用试剂，均为大连宝生物公司产品；常规试剂，为进口分装或国产分析纯试剂。

1.3 菌株的分子鉴定

1.3.1 菌丝体制备及DNA提取 将保存的母种切取5 mm2小块，接种于PDA加富平板培养基中央，25℃黑暗培养5～7 d，待菌丝生长到接近平板边缘，刮取菌落边缘的新鲜菌丝，利用真菌总DNA提取试剂盒提取基因组总DNA。

1.3.2 ITS扩增 参照文献[5]所报道的用于真菌ITS区域扩增的通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增。PCR反应体系和程序参照文献[4]。

1.3.3 序列分析 PCR结束后，取PCR产物4 μL进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果，将有目的条带的PCR产物送北京博尚生物公司测序；将所得DNA序列输入GenBank进行Blast检索，采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 5软件对所得核苷酸序列与GenBank中收录分离物的相应序列进行比较和分析，并构建系统进化树。

1.4 培养特性研究

1.4.1 碳源筛选试验 供试碳源分别为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖，试验方法详见文献[6]。

1.4.2 氮源筛选试验 供试氮源分别为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵，试验方法详见文献[6]。

1.4.3 最佳碳氮源浓度组合 选定适宜碳氮源后，采用L9（34）正交表进行四因素三水平正交试验[7]，组合成供试培养基，接入菌龄一致的5 mm2母种块，置于25℃恒温培养箱中培养，每处理重复5次。

1.4.4 温度试验 于平板边缘取直径5 mm的菌块接种于PDA培养基平板中央，分别置于15、20、25、30、35、40℃条件下倒置暗培养，pH自然，重复设置和分析方法详见文献[6]。

1.4.5 pH值试验 用0.1 mol/L HCl或NaOH溶液调节基础培养基pH值分别为4、5、6、7、8、9，制成平板后接入直径为5 mm的菌块，置于25℃恒温暗培养。重复设置和分析方法同文献[6]。

2 结果与分析

2.1 菌株分子鉴定

2.1.1 ITS序列扩增结果 以提取的真菌总DNA为模板，经PCR扩增，得到长度约为600 bp的目的片段。

2.1.2 ITS序列同源性及系统发育分析 PCR产物直接测序获得了XZG-ts的序列（GenBank登录号为KT725858），其中包括部分18S rDNA、ITS和部分28S rDNA基因序列。进行同源性比对并构建系统发育树，结果表明菌株XZG-ts与GenBank中来自于澳大利亚（CBS100130，EU424311）、印度（ACCC50082，EU424308）和中国云南（CCMSSC00649，EU424313）的3个肺形侧耳菌株聚为一簇，组内核苷酸一致率为100%，而与侧耳属其他4个种的10个菌株核苷酸一致率为98.10%～99.06%，依此结果将XZG-ts菌株鉴定为P. pulmonarius。

2.2 培养特性

2.2.1 不同碳源对菌株菌丝生长的影响 菌株在供试碳源中均能生长且菌丝长势均浓密健壮，果糖中生长速度最快，达0.49 cm/d，其次是麦芽糖，在乳糖中菌丝生长最慢，仅为0.18 cm/d。在供试碳源中，菌丝生长的最适碳源为果糖，其次是麦芽糖。

2.2.2 不同氮源对菌株菌丝生长的影响 在不同供试氮源中菌丝生长速度差异显著，在酵母膏中菌丝生长速度最快，为0.45 cm/d，且菌丝长势浓密健壮；其次是蛋白胨；在硝酸铵中菌丝生长最慢，仅为0.14 cm/d，菌丝长势稀疏。在供试氮源中，菌丝生长的最适氮源为酵母膏，其次是蛋白胨。

2.2.3 菌株菌丝生长适宜碳氮源浓度组合 选用L9（34）正交表进行四因素三水平正交试验（表3），确定碳氮源的最佳浓度组合。表4结果表明，果糖、麦芽糖、酵母膏、蛋白胨4个单因子组合的培养基试验中，菌丝生长速度差异显著。从直观上看，组合2培养基上菌丝生长速度最快，为0.57 cm/d，其次是组合4，组合9培养基上菌丝生长速度最慢；各组合培养基上菌丝均长势壮、浓密。极差分析结果表明，4个单因子对菌丝生长的影响顺序为A>C>B>D，说明果糖对菌丝生长速度影响最大，其次是酵母膏、麦芽糖，酵母膏对菌丝生长速度影响最小。综合评价，菌丝生长最佳碳氮源组合为A1B2C2D2，即：果糖1%、麦芽糖1.0%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.3%。

2.2.4 温度对菌株菌丝生长的影响 菌丝生长受温度影响明显，最适温度为25～30℃，在25℃条件下菌丝日生长速度最快，为0.35 cm/d，其次是30℃，菌丝在15℃和40℃条件下生长缓慢，菌丝日生长速度均低于0.05 cm/d（图2）。

2.2.5 pH对菌株菌丝生长的影响 菌丝在pH 4～10的培养基中均可生长，当pH 6时菌丝生长最快，菌丝日生长速度为0.24 cm/d，pH 7次之，菌丝日生长速度为0.22 cm/d，在pH 6～7范围内菌丝均浓密粗壮。当pH>8时，菌丝生长缓慢，日生长速度均低于0.18 cm/d。由此可见，菌株XZG-ts适宜在中性偏酸环境下生长，最适pH为6。

3 结论

肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）隶属于真菌门（Eumycota）担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricals）侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus）[8]，中文异名秀珍菇、环柄香菇、袖珍菇、环柄斗菇、姬平菇和小平菇等，是一种高蛋白、低脂肪的营养食品，味道鲜美，具有降低胆固醇、提高免疫力、延年益寿之功效。其适宜生长的基质广泛[9]，但子实体形态受环境影响较大，因而其分类学地位难以确定，定名较为频繁[10]。2009年，黄龙花等对我国栽培凤尾菇及其近缘种10个菌株的ITS序列应用特异引物进行PCR扩增，对其产物进行测序，结果表明，目前我国广泛栽培的凤尾菇与肺形侧耳可能是同物异名种，建议订正其名称，将其拉丁名统一定为P. pulmonarius[11]。秀珍菇国内最早2000年文献上使用的学名为Pleurotus geesteranus[12]。张金霞等根据栽培生理结合ITS、RAPD分析表明现在市场上的秀珍菇为P. pulmonarius[13]。谢宝贵等根据ITS-RFLP及ITS序列，交配亲和性研究结果认为秀珍菇定名为P. geesteranus不妥，应该是P. pulmonarius[14]。

本研究通过同源性比对和构建系统发育树，从分子水平上证明菌株XZG-ts为P.pulmonarius。菌株XZG-ts的最适碳源为果糖，最适氮源为酵母膏，最佳碳氮源组合果糖1%、麦芽糖1.0%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.3%，最适生长温度为25℃，最适pH为6。

参 考 文 献：

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