吐尔逊娜依·迪力夏提 刘旭新 石强

[摘要]以山东和新疆白皮大蒜栽培品种为材料，建立了大蒜鳞芽为外植体的愈伤组织诱导再生体系。采用MS培养基，通过激素配比筛选试验，比较快速诱导愈伤组织激素配比与方案，为供试大蒜品种脱病毒苗的快速繁殖奠定了基础。筛选得到愈伤组织快速诱导与生长培养基与激素配比，结果表明：快速诱导愈伤组织最佳激素组合为：NAA 0.5mg/L+2，4-D 1.25mg/L+MS，愈伤组织继代生长与幼苗分化激素组合为：6BA 5mg/L+NAA0.3mg/L，环境温度25℃，光照16小时，8小时黑暗条件；所有这些结果为大蒜脱毒再生苗提纯复壮与转基因研究体系的建立都很有帮助。

[关键词]大蒜；组织培养；再生体系

[中图分类号]S633.4 [文献标识码]A

大蒜（Allium sativum L.）为百合科葱属植物蒜的鳞茎，是因其具有独特的风味和良好的药用价值而全球性食用并种植的蔬菜。我国栽培历史已达两千多年，是世界最大的大蒜种植国，全国各地都有栽培。栽培大蒜由于花器官败育，不能通过有性生殖形成种子，所以在生产中都是通过无性繁殖进行生产。大蒜在栽培过程中，常年无性繁殖过程使其出现容易染病毒、品种退化等问题，最终导致质量及产量下降，大家通常利用组织培养技术来进行大蒜组织脱毒，脱毒的分生组织再分化成无毒幼苗，这已经成为提升大蒜品质的一个手段。目前脱毒组织培养技术，已建立了以茎尖、根尖，真叶、贮藏叶、茎盘切块、花序轴顶端分生组织，花药和花原始体等为外植体的多种大蒜组织培养再生体系。各种外植体与其分化再生效果都有差异，本实验利用大蒜鳞芽作为外植体选用不同植物激素之间优化配比，对大蒜愈伤组织诱导进行试验，研究对比提出了一种高效的大蒜组织培养体系，为进一步对大蒜进行深入研究，如大蒜脱毒愈伤组织快速诱导到再生植株的成功分化，以及建立大蒜转基因转化体系，做一些基础工作，得到了比较好的再生体系模式。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料是山东白皮大蒜（产地山东）和新疆白皮大蒜（吉木萨尔县），从新疆昌吉市市场购买的当年新蒜。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配制及培养条件。基本培养基为MS固体培养基（M&S M519，Phytotechnology公司产品）含蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值5.8，在培养箱中光照培养，培养温度（25±1）℃，光强4000～5000lux培养于光照24h/d。植物激素采用2，4-D，6BA，2IP，NAA等（SIGMA公司产品）。

1.2.2 外植体准备。取无病无霉变的大蒜瓣放入清水中浸泡l0min，然后用無菌水冲净，在超净台上将大蒜瓣横切成2段，将有鳞芽的一段放入培养皿，切开剥出鳞芽，切2～3块，10%的次氯酸钠溶液中浸泡2min，后用无菌水冲洗3～5次。

1.2.3 愈伤组织诱导培养。将外植体接种在添加不同浓度配比激素组合（共42个处理）的MS培养基上，每瓶接种10个外植体，每个处理4～5瓶，接种15d后开始观察及统计直径超过3mm的愈伤组织。40d后继代培养一次，使用相同的培养基，继代培养1～2次。

1.2.4 数据记录与处理。 经不同配比的激素组合处理的大蒜鳞芽愈伤组织，不定芽和生根情况各在培养40d和20d后开始进行记录。通过目测法观测不同激素配比对大蒜鳞芽组织培养的影响，观察记录愈伤组织发生率来计算愈伤组织诱导率，统计方法如下式所示：

2 结果与分析

2.1 不同激素配比处理对大蒜鳞芽愈伤组织诱导的影响

以MS固体培养基为基本培养基进行生长素与细胞分裂素的不同配比组合（共42个处理，激素配比与组合见表1），研究不同组合对大蒜鳞芽愈伤组织诱导率影响的试验。大蒜愈伤组织在诱导培养20d左右开始出现，可以从外植体的一端或两端或者整个外植体上产生，25d左右达到计数水平。经观察计数得到各处理对大蒜鳞芽愈伤组织诱导率影响结果如表l。

当2，4-D浓度为1mg/L时，大蒜鳞芽诱导率随NAA浓度的增加而降低；当NAA浓度为0.5mg/L时，诱导率随2，4-D浓度的增加而增加，但2，4-D浓度超过1.25mg/L开始诱导率反而不再上涨。当2iP浓度为0.1mg/L时2，4-D浓度为1.5mg/L时的山东大蒜鳞芽愈伤组织和2，4-D浓度为2mg/L时的新疆大蒜鳞芽愈伤组织诱导率效果最好。

2.2 不同处理愈伤组织幼芽分化诱导的影响

大蒜愈伤组织成功诱导出来后，选定不同浓度配比的激素（6BA）继续进行培养，能成功诱导分化出幼芽（图1），但是大蒜愈伤组织诱导成芽需要更长时间（表2）。

3 结论

本研究综合考虑大蒜鳞芽组织愈伤组织形成率和周期等关键因素，从控制诱导与分化的角度筛选最佳植物激素组合的培养基，有利于大蒜鳞芽组培再生技术的推广应用。单子叶植物转化体系往往采用农杆菌携带目的基因转化愈伤组织，通过抗性筛选得到转化植株，所以此实验不仅对大蒜深入进行生物工程研究打下基础，而且对大蒜转基因体系的建立都具有重要应用价值。

4 展望

随着生物技术手段的不断丰富，组织培养技术作为重要的技术手段，为人类科学的进步和发展提供了强大的支撑，而大蒜的组织培养和快繁技术的完善使蒜苔和鳞茎产量有所增加，高产量及质量的目的达到了。然而脱毒植株在实际应用中可能再度感染，加之试管繁殖系数尚低，因而规模化生产技术还需进一步研究。而将现代生物技术纳入大蒜植物的遗传改良和育种程序，将会加速培育出高品质、高抗逆性、更有应用价值的新品种，以满足人们生活水平不断提高的需求。

[参考文献]

[1] 胡小京，耿广东，王建龙.大蒜组织培养快繁技术的研究[J].长江农业， 2011（20）：13-15.

[2] 宋满坡.大蒜茎尖的组织培养[J].信阳农业高等专科学校学报，2005（15）： 86-87.

[3] 王云云，高宇，肖宇.大蒜茎盘不定芽离体培养的研究[J].黑龙江科学，2013，4（3）：67-71.

[4] 张恩让，程智慧，周新民.大蒜体细胞无性系的染色体变异研究[J].西北农业林科技大学（自然科学版），2004，32（9）：73-76.

[5] 罗莉斯·李，王少铭.大蒜组织培养研究进展[J].农技服务，2015，32（9）：80-81.

[6] 王旭静，王志兴·唐.以根为外植体建立大蒜的组织培养体系[J].生物技术进展，2011，1（2）：140-145.

[7] Ayabe M，Taniguchi K and Sumi S.Regeneration of whole plants from protoplasts isolated from tissue-cultured shoot primordia of garlic （Allium sativum L.） [J].Plant Cell Rep，1995，15（1-2）：17-21.

[8] Nagasawa A FJJ.Development of morphogenic suspension cultures of garlic （Allium sativum L.）[J].Plant Cell Tissue and Organ culture，1988， 15（2）：183-187.

[9] Sata S.J BSB，Thaker V S.Induction of direct somatic embryogenesis in garlic（Allium sativum L.） [J].Method CellSci，2000，22（4）：299-304.

[10] 梁燕，陈典，黄晓梅.大蒜试管微鳞茎形成的激素筛选研究[J].东北农业大学学报，2005，36（5）：589-592.

[11] 张素芝，李纪蓉.植物激素对大蒜茎盘组织培养的影响[J].西南农业大学学报（自然科学版），2006，28（5）：805-808.