石 炜

在世界范围内胃癌是第二位引起癌相关性死亡的癌症，是第四位最常见的恶性肿瘤[1]。随着发病率的上升，胃癌已经成为一种严重危害人类健康的疾病。同其他许多人类癌症一样，胃癌的发生发展涉及众多因素参与，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活等。

MiRNA是一类非编码RNA小分子，长度大约20～25个核苷酸，通过调控特异靶基因活性参与许多人类疾病的发生[2-3]。已有研究表明，异常的miRNA表达参与了肿瘤的发生发展[4-5]。MiR-199于2003年被首次认识，它包含两个发夹前体，分别在1号和19号染色体上，此两种发夹前体可被切割成两种成熟体，即miR-199a/b-3p和miR-199a/b-5p[6-8]。已有研究发现miR-199a/b-3p作为一种抑癌基因参与了许多人类肿瘤的发病过程，包括肝细胞癌[7]、甲状腺乳头状癌[9]、子宫内膜样腺癌[10]、肾细胞癌[11]、骨肉瘤[12]、卵巢癌[13]和乳腺癌[14]。 目前还不清楚它是否参与胃癌的发病过程。本研究旨在探讨miR-199a/b-3p在胃癌中的表达及其对胃癌细胞的增殖功能的影响。

材料与方法

一、材料

1.临床标本

收集20对胃癌和对应的癌旁组织，提取总RNA用于MiR-199a/b-3p表达水平的检测。MiR-199a/b-3p表达水平与临床病理的相关性如表1所示。

表1 MiR-199a/b-3p表达水平与胃癌患者临床病理的相关性

2.细胞系

人胃癌细胞株MGC-803（CBP60485）购自南京科佰生物科技有限公司。细胞培养：用含有10%胎牛血清（HyClone）的RPMI 1640培养基在37℃，5%CO2的培养箱中培养。

3.试剂

cDNA逆转录试剂盒购自Takara公司。qPCR试剂盒购自Roche公司。抗PAK4、p-MEK、p-ERK和β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司。MTT和DMSO购自Sigma公司。

二、方法

1.细胞转染

MiR-199a/b-3p mimics和阴性对照试剂（negative control,NC）购自RIBOBIO公司，PAK4-siRNA购自苏州吉玛公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，转染前1天在6孔板中按每孔接种约2×105个细胞，细胞汇合达70%～90%进行转染，在一1.5 mL离心管中加250 μL无血清DMEM培养基，再加入100 pmol mimics或siRNA，柔和混匀，在另一1.5 mL离心管中加入250 μL无血清DMEM培养基，再加入5 μL Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温放置5 min，然后将两管轻轻混匀，室温放置20 min，将混合液加到含培养基的孔板内，最后将6孔板放入培养箱孵育，48 h后进行转染后的其他检测步骤。

2.实时定量PCR检测核酸表达水平

用Takara公司的RNAiso试剂盒抽提细胞和组织的总RNA，按cDNA逆转录试剂盒和qPCR试剂盒说明书操作，分别用U6和β-actin作为miR和mRNA的内参，采用2-ΔΔCT法分析数据。实验中用到的引物序如表2所示。

表2 实验中用到的引物序列

3.Western blot检测蛋白表达水平

分别选取上面转染实验处理的细胞，参照《分子克隆》的实验步骤，提取总蛋白质，40 μg总蛋白用不连续SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白转移至硝酸纤维素膜，丽春红S染色，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入抗PAK4、p-MEK、p-ERK和β-actin抗体，均按1:1 000稀释，4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育4 h，然后用Millipore发光液显色。以β-actin为内参。

4.MTT法检测细胞增殖

分别选取前述转染实验处理的细胞，以5×103个/孔的细胞密度接种于96孔板中。分别在培养0、24、48、72 h 后， 每孔加入 MTT 溶液 （5 mg/mL）20 μL，继续培养4 h后终止培养，吸干孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡至结晶充分溶解，选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值。

三、统计方法

采用SPSS16.0统计分析软件对数据数进行处理。计量资料以表示，采用方差分析；计数资料以%表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MiR-199a/b-3p抑制MGC-803细胞增殖

通过分析胃癌和相应癌旁组织中MiR-199a/b-3p的表达水平，发现癌组织中的表达显著减少（图1 A）。MGC-803细胞转染 miR-199a/b-3p mimics后，miR-199a/b-3p的表达量显著增加，表现为浓度依赖性 （图1 B）。细胞增殖实验发现，转染miR-199a/b-3p mimics后，细胞的增殖活性下降 （图1C）。

图 1 miR-199a/b-3p抑制胃癌细胞 MGC-803增殖（*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）

二、MiR-199a/b-3p抑制 MGC-803细胞中PAK4的表达

通过生物信息学分析发现，PAK4是MiR-199a/b-3p可能的靶点调控基因（表3）。MGC-803细胞转染miR-199a/b-3p mimics后，PAK4的mRNA和蛋白表达都显著性减少（图2）。

图2 miR-199a/b-3p下调胃癌细胞MGC-803中PAK4的表达（*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001）

三、MiR-199a/b-3p通过 PAK4/MEK/ERK通路抑制MGC-803细胞增殖

通过生物信息学分析发现，MiR-199a/b-3p靶标基因最富集的信号通路是MAPK通路 （图3）。MGC-803细胞转染miR-199a/b-3p mimics后，发现p-MEK和p-ERK表达水平均减少。此外，MGC-803细胞转染PAK4 siRNA后，p-MEK和p-ERK表达水平均显著性减少和细胞的增殖活性下降（图 4）。

表3 PAK4是MiR-199a/b-3p的靶点基因

讨 论

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发生和发展涉及多种癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的细胞生物学行为的改变等[1]。miRNAs是一类长度在约20个核苷酸的非编码小分子RNA，参与多种人类疾病的发病过程。目前已知miR-199a/b-3p作为一种抑制基因参与多种肿瘤细胞的抑制增殖作用，但在胃癌中的表达和功能还不清楚。因此，本研究的目的是检测miR-199a/b-3p在胃癌组织中的表达水平以及它在胃癌的发病过程中起到什么样的功能。

图3 MAPK通路是MiR-199a/b-3p靶标基因最富集的信号通路（数据来源https://www.gcbi.com.cn）

图4 MiR-199a/b-3p通过PAK4/MEK/ERK通路抑制MGC-803细胞增殖（**P＜0.01；***P＜0.001）

通过检测胃癌组织中miR-199a/b-3p的表达水平，结果显示相比对应的癌旁组织，它在胃癌组织的表达水平明显减少（图1A）。本研究发现，与对照组相比，转染miR-199a/b-3p minics的MGC-803细胞增殖活性显著降低（图1C），提示miR-199a/b-3p能抑制胃癌细胞MGC-803的增殖活性。通过生物信息学分析发现，PAK4是miR-199a/b-3p的靶标基因（表3），而MAPK通路是miR-199a/b-3p靶标基因最富集的信号通路（图3）。我们接下来研究表明，miR-199a/b-3p是通过PAK4/MEK/ERK通路调控胃癌细胞MGC-803的增殖活性。MGC-803细胞转染miR-199a/b-3p minics后，PAK4表达水平显著性减少（图2），而细胞转染PAK4 siRNA后，MEK和ERK磷酸化水平显著性减少，同时发现MGC-803的增殖活性也明显降低（图4）。这些结果提示MiR-199a/b-3p通过PAK4/MEK/ERK通路抑制MGC-803细胞增殖。

尽管我们的研究发现miR-199a/b-3p作为一种抑癌基因在胃癌组织中低表达，但有研究表明miR-199a/b-5p在胃癌组织中高表达，通过调控靶标基因klotho的表达行使促癌基因的功能[15-16]。通过分析miR-199a/b-3p和miR-199a/b-5p的序列结构信息，我们发现两者虽然都是miR-199a/b的成熟体，但它们的序列是不一样的，分别是5′-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3′和 5′-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3′（数据来源http://www.mirbase.org）。此外，通过分析两者的靶基因，发现它们的靶点基因也不同（表4），这些结果表明虽然两者都属于miR-199a/b的成熟体，但是由于两者序列不同，它们行使的功能也不同。

表4 根据PCT值排前十位的miR-199-3p/5p靶标基因

总之，我们的研究表明MiR-199a/b-3p通过下调PAK4/MEK/ERK通路对胃癌的增殖产生抑制作用，可作为一种新的胃癌预后生物标志物和潜在的胃癌生物学治疗靶点。

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