屠云洁，束婧婷，苏一军，章 明，姬改革，刘一帆，巨晓军，邹剑敏

（江苏省家禽科学研究所，江苏省家禽遗传育种重点实验室，江苏扬州 225125）

鸡主要组织相容性复合体（Major Histocompatibi1ity Complex，简称MHC）位于16号染色体上，又称为B复合体，共包括B-F、B-L和B-G 3个座位。B-F区相当于哺乳动物基因的I类抗原；B-L区对应于哺乳动物MHC基因的Ⅱ类抗原；B-G区编码产物又称Ⅳ类抗原[1-3]。MHC基因具有高度的多态性，且与生存环境密切相关[4-5]。相对野生动物，养殖条件下传染病病原是家禽的主要威胁，MHC基因的多态性更多是主要病原体选择的结果[6]。MHCⅡ类分子主要递呈外源性抗原，而内源性抗原的递呈则由MHCⅠ类分子负责。MHCⅠ类分子分布较广泛，几乎表达于所有有核细胞表面，但不同的组织细胞表达Ⅰ类抗原的密度各不相同[7]。鸡MHCI基因有2个拷贝，称为BF1和BF2，转录方向相反，BF2优势表达，基因组DNA全长约2 kb，由8个外显子和7个内含子组成[8-10]。

狼山鸡是我国古老的优良地方品种，目前采用保种场和基因库保种，国家级地方鸡种基因库（江苏）于2000年引种进行异地保护，多年来一直采用家系等量随机保种法继代繁殖，至今已保存17个世代。为监测狼山鸡保种效果，通过Illumina平台Miseq重测序方法分析0（G0）、5（G5）、10（G10）、12（G12）、14（G14）、15（G15）、17（G17）世代的MHCBF1和BF2基因座多态性，以揭示狼山鸡不同世代间MHCBF1和BF2基因序列变异，为更好地监测保种效果提供科学的决策依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 狼山鸡保种群 G0、G5、G10、G12、G14、G15、G17（每个世代20个样品），随机从江苏省家禽科学研究所基因库保存的狼山鸡血样中随机抽取。实验用Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL2000 Markerk均购自上海生物工程有限公司。

1.2 总DNA提取 DNA 提取按照分子克隆的方法[11]。

1.3 鸡MHCBF1和BF2基因全序列多态性分析Illumina平台测序，DNA文库建立，Miseq测序和统计分析，使用多重PCR方法构建DNA文库，扩增子大小为300～400 bp。不同的样品通过不同的引物区分（引物序列见表1），并对扩增子进行高通量测序。使用Illumina MiSeq测序平台进行测序，测序模式配对结束，测序读取长度为2×300 bp。序列数据是通过使用Cutadapt软件去除连接器序列得到（DOI http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200）。序列比对软件BWA（v0.7.12）用于比较切割后参照序列的MHCBF1和BF2序列。Genesis Analysis Toolkit（GATK）软件用于突变检测(http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices)。

1.4 统计分析 根据每个样本的等位基因基因型，获得基因的等位基因数、等位基因频率（Pi）、平均观察杂合度（Ho），平均期望杂合度（He）和多态性信息含量（PIC）。Ho=观察得到杂和个体数/样本个体数总数。He根据Nei）[12]提供的公式计算：

其中，pi是第i个等位形式的频率，n是等位形式的数目。

PIC根据Bostein等[13]的公式计算：

其中，Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数。

使用SPSS 16.0比较狼山鸡保种群G0、G5、G10、G12、G14、G15、G17世代的平均 He、Ho和PIC。P＜0.05为差异显著水平。

2 结果与分析

应用重测序的方法得到狼山鸡G0、G5、G10、G12、G14、G15、G17MHCBF1（2768bp）、BF2（2204 bp）的全长序列。在狼山鸡7个世代中分别鉴定出MHC BF1、BF2基因59和34个SNPs。如表2所示，狼山鸡MHCBF1基因 Ho、He、PIC在 G10、G12、G14保持稳定，Ho在不同世代变化情况为G17＞G15＞G14、G12、G10 ＞G5＞G0，He 和 PIC 在不同世代变化情况为 G17、G15＞G14、G12、G10＞G5＞G0（P＜0.05），MHCBF2基因的Ho在G10、G14、G15保持稳定，其他世 代 变 化情况为 G17、 G12 ＞G15、G14、G10＞G0、G5（P＜0.05）；He 和 PIC 在 G12、G14、G15和G17，保持稳定，在其他世代变化情况为G17、G15、G14、G12＞G10＞G5、G0（P＜0.05）。

表1 狼山鸡MHC BF1和BF2引物序列

表2 不同世代MHC BF1基因Ho、He和PIC

表3 不同世代MHC BF2基因Ho、He和PIC

3 讨 论

MHC进化机制主要是病原体选择机制，MHC多态性能够反映动物种群生活史的适应性进化和生存能力。MHC基因的变异可反映基因组水平的变异，通过MHC基因的变异分析，可有效地评估品种遗传多样性的水平。因此，MHC基因被认为是群体遗传学和保护遗传学研究中最新的基因系统[14]。

杂合度又称遗传多样性，是反映被测基因座位的遗传变异，通常被认为是衡量群体遗传多样性较适合的遗传参数。本研究发现，狼山鸡MHCBF1基因He范围是0.23～0.47，G0最低，G0～G17群体遗传多样性逐渐升高，G15和G17最高，杂合度与PIC结果一致。随着世代的增加，MHCBF1和BF2基因的纯合度下降，遗传多样性增加，其中G0遗传多样性最低，可能是因为狼山鸡G0时亲缘关系程度较高，狼山鸡保种群于2000年组建，此后，避免全同胞和半同胞交配，杂合度和PIC从G5到G17逐渐增加，MHCBF1基因遗传多态性的增加，也为MHC基因适应不断变化的抗原创造了条件，MHC基因多态性是其编码的蛋白质参与抗原呈递的重要的分子基础[15-16]。G10、G12和G14基本保持稳定，这可能是因为狼山鸡保种群逐步适应当地的环境，抗病性比较好，也反映G10、G12、G14狼山鸡免疫系统对外来寄生物（细菌、病毒、寄生虫等）识别和反应比较稳定。MHCI类（MHCBF1，BF2）分子识别并结合内源性肽段（主要来自于细胞胞浆内的病原微生物，如病毒或细菌等），负责外源抗原的识别和表达MHC基因的变异水平，MHCBF基因不断直接影响个体对病原体疾病的抵抗，对不断变化的外界环境的适应能力起着关键作用[17]。

狼山鸡MHCBF基因不同世代遗传多样性的变化符合波动选择（时空变换的选择）假说，病原体的种类波动变化造成了对种群个体选择密度的变化，从而维持了群体中MHC的多样性[18]，随着时间的推移和空间的变换，病原体的种类与多样性跟着变化，相应地，宿主对病原菌和寄生虫等易感性也会变化。病原体抗原的空间多样性会直接导致在不同地区产生不同的选择压力[19]。倘若在种群间存在有限基因交流或者存在空间交流阻碍，MHC多态性会导致种群对当地特有的病原微生物群体的适应性。狼山鸡保种群一直被保存在国家级地方鸡种基因库，不存在空间交流情况，这也可能是由于随着时间的推移，保种群逐步适应当地病原微生物群，保种群MHC BF基因遗传多样性基本保持稳定。

4 结 论

狼山鸡不同世代MHCBF1和BF2遗传多样性变化规律不太一致，但总体规律符合波动选择（时空变换的选择）假说，随着时间的推移MHCBF基因遗传多样性变得更为丰富，在某些连续几个世代群体遗传多样性基本保持稳定，这可能与MHCBF基因功能有关。

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