冉飞勇 付雷 王彬 郭少晨 陆宇 陈效友

结核病是全世界的第九大死因，在传染性疾病中排名第一。根据WHO 2017年报告，2016年全球范围内估计有1040万例结核病新发患者，死亡约170万例；我国结核病新发患者89.5万例，死亡6.8万例，结核病在全球及我国疫情形势依然严峻[1]。

结核病化学治疗面临着疗程长，不良反应多，患者依从性差，导致诸多患者，尤其是复治和耐药结核病患者疗效不确切。由于抗结核新药开发困难，近40年来仅有贝达喹啉和德拉马尼两种新药上市[2-5]，耐药结核病患者的化学治疗受到严峻挑战。因而，开发一些辅助结核病治疗措施，在提高疗效、缩短痰菌阴转时间及(或)缩短疗程方面显得尤为急切。维生素D是结核病免疫辅助治疗的代表药物之一，在抗生素出现之前，高剂量的维生素D被用来治疗肺结核并取得了较好的效果[6]。然而，维生素D辅助治疗结核病的疗效报道结果不尽一致[7-11]。为此，笔者建立豚鼠结核病动物模型，评价每日给予常规剂量维生素D和单次高剂量维生素D隔周给药两种方式辅助治疗豚鼠结核病的效果，探讨维生素D在结核病治疗中的价值。

材料和方法

一、材料

1.菌株：结核分枝杆菌标准株(H37Rv， ATCC27294)为首都医科大学附属北京胸科医院耐药结核病研究北京市重点实验室保存。

2.实验动物：无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级4～6周龄豚鼠(Hartley品系)56只，雌雄各半，体质量为300～350 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；实验动物使用许可证号：SCXK(京)20160011。饲养条件：室温为(21±2) ℃，湿度为(55±15) %，可自由进食水的负压感染动物房。本研究经首都医科大学附属北京胸科医院动物伦理委员会批准。

3.实验药物：实验级维生素D3原(批号G131861)，购于德国Dr.Ehrenstorfer 有限责任公司；异烟肼标准品(批号MKBZ8025V)、利福平标准品(批号WXBC3355V)均购于美国Sigma公司。

4.试剂：1×PBS(磷酸盐缓冲液)，Tween80(批号2016-06-01)购于无锡市亚泰联合化工有限公司；实验级花生油(批号1F6E770)，购于瑞典化学(上海)技术有限公司； OADC(oleic acid-albumin-dextrose-catalase； 油酸-白蛋白-右旋糖-过氧化氢酶)增菌液(批号7082603)，购于美国BD公司。

5．仪器：气溶胶感染装置(型号：099CA4224)，购于美国Glas-Col公司；雾化器、匀浆机(型号：PRO200)均购于美国PRO Scientific公司；二氧化碳培养箱(型号MU5810E),购于美国MUAIRE公司；酶标仪(型号：BioTek Synergy2)，购于美国BioTek仪器有限公司。

二、方法

1.感染用菌液的制备：用1×PBS+0.04%Tween 80稀释H37Rv标准株冻存液(浓度为4×108CFU/ml)至感染浓度5×105CFU/ml，终体积为40 ml。取0.1 ml稀释的菌悬液接种于7H11培养基上，在37 ℃的CO2培养箱中孵育3周，观察结核分枝杆菌菌落生长情况，计算活菌数及其对数值(lgCFU)。

2.建立豚鼠慢性结核病模型:按照气溶胶感染装置操作程序，雌雄各28只豚鼠分批进行。将待感染豚鼠放入感染装置，关闭腔室，吸取10 ml菌悬液(5×105CFU/ml)加入雾化器，按照预热15 min、雾化30 min、烟雾衰减30 min、净化15 min等步骤进行雾化感染和杀菌消毒。感染后豚鼠分笼饲养于负压感染动物房内，感染10 d后随机抓取4只(雌雄各半)用于验证感染是否成功，感染28 d随机抓取4只(雌雄各半)作为实验基线。

3.实验分组及给药方式：将气溶胶方式感染后的48只豚鼠随机分为6组，分别是空白对照组，每日常规剂量维生素D组(VD组)，单次高剂量维生素D隔周给药组(VDH组)，异烟肼-利福平化疗组(H-R组)，异烟肼-利福平化疗联合每日常规剂量维生素D给药组(H-R+VD组)，异烟肼-利福平化疗联合单次高剂量维生素D隔周给药组(H-R+VDH组)，每组8只，雌雄各半；均灌胃给药，采用1.6 mm×80 mm弯头灌胃针进行灌胃给药，每天记录有无不良反应发生。

4.给药剂量和频次：依据文献[7，12]，本研究设定了2种补充维生素D的方式：每日常规剂量(10 000 IU， 1次/d)和单次高剂量(100 000 IU，隔周1次)。根据人体和豚鼠等效剂量公式换算为豚鼠给药剂量，按照每日常规剂量(775 IU/kg，1次/d)和单次高剂量(7750 IU/kg，隔周1次)2种方式给药。由于豚鼠生长快，需每周称取豚鼠体质量，计算给药量，配制药物。异烟肼和利福平分别用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制成混悬液，给药终体积为0.1 ml；维生素D3原溶于实验级花生油，给药终体积为0.1 ml。采用溶剂对照方法设置分组和给药，见表1。

5.观察豚鼠生长情况：给药同时观察豚鼠生长情况，每周称取豚鼠体质量。

6.豚鼠解剖和脏器称质量：给药4周和8周后每组取4只豚鼠(雌雄各半)，称取豚鼠体质量，采用空气栓塞法处死豚鼠并解剖，留取肺脏和脾脏标本，观察脏器病变并称质量。

7.活菌计数：每只豚鼠1/2(左半)肺脏加入含10 ml生理盐水的匀浆管中，用匀浆机(10 000 r/min)匀浆，取1/2(左半)脾脏加入含5 ml生理盐水的匀浆管中，用匀浆机匀浆(10 000 r/min)。根据病变程度接种不同的稀释度，10倍系列4个梯度稀释，每个稀释度取0.1 ml接种于7H11培养基，37 ℃恒温箱培养，3 周后进行菌落计数，并计算每只豚鼠肺脏和脾脏的活菌数，以对数形式表示。

8.组织病理学检查：取实验中各组豚鼠1/2(右半)肺脏、脾脏固定于10%福尔马林水溶液中，石蜡包埋切片，苏木精/伊红染色后，高倍镜下观察各组织的病理改变。根据结核特异性改变从病变范围、原发损伤、继发损伤、坏死等4个角度对每个脾脏和肺脏病理切片进行评分，评分标准如下：(1)病变范围评分：未见病变计0分，病变范围≤25%计1分，25%<病变范围≤50%计2分， 50%<病变范围≤75%计3分，病变范围>75%计4分。(2)原发损伤：未见原发病灶计0分，单个原发病灶计1分，2个或以上计2分，多个并有融合计3分，多个广泛融合计4分。(3)继发性损伤：未见继发性损伤计0分，继发性损伤范围≤25%计1分，25%<继发性损伤范围≤50%计2分，50%<继发性损伤范围≤75%计3分，继发性损伤范围>75%计4分。(4)坏死：未见坏死计0分, 极轻微坏死计1分，轻微坏死计2分，中度坏死计3分,显著坏死计4分，重度坏死计5分。

表1 不同组别结核感染豚鼠的给药剂量与频次

注VD组：给常规剂量维生素D3原；VDH组：给高剂量维生素D3原组；INH：异烟肼；RFP：利福平；H-R:INH+RFP；0表示不加对应的药物，仅给予配制该药物的溶剂；qd:1次/d

结 果

一、豚鼠一般情况

实验期间(包括感染和给药期间)豚鼠未出现死亡。感染前豚鼠平均体质量(310.01±13.74)g，开始灌胃前(计为0周)平均体质量达到(491.16±35.94)g，开始给药后豚鼠体质量稳步增长，每周体质量增加(30.87±7.90)g，给药4周和8周时豚鼠体质量情况见表2。比较8周各组体质量增长量，VDH组增长最快，平均增长体质量275.63 g；而H-R 组增长最慢，平均增长体质量155.66 g，可见单次高剂量维生素D隔周给药有利于豚鼠体质量增长。

二、活菌计数情况

1. 气溶胶感染及活菌计数：豚鼠分2次(雌性和雄性)完成气溶胶感染，分别对2次感染菌液进行活菌计数，取对数值为5.65 CFU/ml和5.55 CFU/ml，提示雌性和雄雌动物2次感染菌量一致。

2.感染10 d后活菌计数：感染10 d后随机取4只豚鼠(雌雄各半)解剖，对肺脏和脾脏进行活菌计数，肺脏活菌计数均值为(4.56±0.07) lgCFU，感染模型建立成功。脾脏活菌计数未见生长。

3.感染28 d后活菌计数：感染28 d后随机取4只豚鼠(雌雄各半)解剖，对肺脏和脾脏进行活菌计数作为治疗前基线，肺脏活菌计数均值为(5.40±0.21) lgCFU，脾脏活菌计数均值为(4.90±0.07) lgCFU。

4.给药4周和8周豚鼠肺脏和脾脏活菌计数：单独维生素D治疗，VD组与VDH组给药4周和8周后均未见MTB菌落数下降。治疗4周H-R组肺脏和脾脏活菌计数分别为(4.98±0.26) lgCFU和(4.02±0.03) lgCFU, H-R+VDH组肺脏和脾脏活菌计数分别为(4.39±0.11) lgCFU和(2.30±0.43) lgCFU；H-R+VDH组较H-R组肺脏和脾脏活菌计数分别下降了0.59 lgCFU和1.72 lgCFU；治疗8周后H-R组肺脏和脾脏活菌计数分别为(3.73±0.23) lgCFU和(2.26±0.24) lgCFU； H-R+VDH组肺脏活菌计数为(3.21±0.23) lgCFU，脾脏达到无菌化；H-R+VDH组较H-R组肺脏和脾脏活菌计数分别下降了0.52 lgCFU和2.26 lgCFU。治疗4周后H-R+VD组脾脏活菌计数为(2.36±0.10) lgCFU， H-R+VD组较H-R组脾脏活菌计数下降了1.66 lgCFU(表3)。

三、病理结果

1.肉眼观察：解剖豚鼠可见肺脏局部肿胀和挛缩变形，表面可见大小不等的结节样原发病灶，直径约0.1～0.4 cm，呈灰黄色。脾脏病变可见不同，治疗4周时空白对照组(图1)豚鼠脾脏明显肿大，表面凹凸不平，可见布满大小不等的结节；VD组和VDH组均未观察到病变减轻，脾脏外观与空白对照相近；H-R组(图2)可见脾脏水肿及少量结节样改变；H-R+VD组(图3)、H-R+VDH组(图4)则能看到病变明显减轻,脾脏变小变薄，表面光滑，结节样病变消失，接近正常豚鼠脾脏外观。治疗8周时，空白对照组、VD组、VDH组脾脏与图1相似；H-R组、H-R+VD组、H-R+VDH组脾脏均与图3和图4相似。

表2 不同组别结核感染豚鼠给药0、 4和8周后的体质量

注VD：给常规剂量维生素D3原；VDH：给高剂量维生素D3原；INH：异烟肼；RFP：利福平

表3 不同组别结核感染豚鼠给药4周和8周后的肺脏和脾脏活菌计数情况

注“-”表示H-R+VDH治疗组给药8周后脾脏未见菌落生长，无法取对数值，比较该组与其他各组的差值时，以活菌计数差值的对数表示

图1～4 治疗4周后空白对照组(图1)、H-R组(图2)、H-R+VD组(图3)、H-R+VDH组(图4)的脾脏外观

2.组织病理学：在光学显微镜下观察各组肺脏和脾脏的病理切片并评分。对每组评分进行汇总后可见：与空白对照组比较，VD组和VDH组均未见病变减轻；而H-R+VDH组治疗4周后脾脏病理评分低于其他各组(表4)，治疗8周后肺脏病理评分低于其他各组(表5)。

高倍镜下观察：治疗4 周时空白对照组肺脏病变范围大，肉芽肿内有大量坏死和钙化灶，肺泡细胞被上皮样细胞和淋巴细胞取代(图5)；脾脏病变范围大，组织结构被肉芽肿病变破坏，视野内布满上皮样细胞和淋巴细胞，并可见少量坏死和钙盐沉积(图6)。H-R+VD 组治疗8 周后肺脏未见肉芽肿及坏死，接近正常肺组织形态(图7)。H-R+VDH组治疗4周后脾脏也接近正常脾组织形态(图8)。

表4 不同组别结核感染豚鼠给药4周后的脾脏病理学评分

表5 不同组别结核感染豚鼠给药8周后的肺脏病理学评分

图5～8 分别为高倍镜下空白对照组治疗4周后的肺脏标本病理切片(图5)和脾脏标本病理切片(图6)，H-R+VD组治疗8周后的肺脏标本病理切片(图7)，H-R+VDH组治疗4周后的脾脏标本病理切片(图8)

讨 论

结核病仍然是危害人类健康的重要传染性疾病，耐药结核病形势严峻。化学治疗是结核病防治的主要手段，目前抗结核药物治疗存在周期长、依从性差，以及二线治疗药物不良反应多、治愈率低等问题。在抗结核新药研发周期长、进展缓慢的情况下，开发化学辅助药物以减轻患者症状，提高患者耐受性，增加疗效是积极有益的尝试。研究较多的辅助药物主要有疫苗类药物、细胞因子、抗体、免疫调节剂等，这些药物大多给药剂量和给药时间不统一、疗效评价指标过于单一、治疗费用高，尚缺乏严格的多中心随机对照试验支持等问题。

维生素D是人体必需的脂溶性维生素，它的主要生理作用是通过其活性代谢产物调节钙磷和骨代谢，随着研究的深入，维生素D更广泛的生理作用不断被发现。文献报道了维生素D缺乏与多种疾病有关，包括结核病、多发性硬化[13]、糖尿病[14]、癌症[15]等。近年来，许多基础研究报道了维生素D在结核病中的作用：体外实验证实维生素D活性形式1,25(OH)2D3能刺激单核细胞向巨噬细胞的分化，并促进巨噬细胞的成熟，增强其杀菌能力[16-18]；维生素D还能促进巨噬细胞抗菌肽的表达[19]，并增强其杀灭MTB活性的作用；也有研究发现，维生素D能够调节T淋巴细胞的增殖，介导免疫耐受[20-21]；在C3HeB/FeJ品系小鼠的结核病模型中证实，维生素D在结核病后期能抑制免疫损伤[22]。临床研究中也发现，维生素D缺乏能增加糖尿病患者罹患结核病的风险[23]，多项Meta分析数据均显示维生素D受体基因多态性也与结核病发病相关[24-25]。然而，临床多中心随机对照试验未发现补充维生素D能加快痰菌阴转的阳性结果[7]；Cegielski and Vernon在关于这篇报道的评论中指出：以痰菌阴转作为评价维生素D的疗效指标不是很理想，它的作用体现在减轻炎症反应、限制组织损伤、防止复发等[26]。据此本研究拟应用豚鼠动物模型从体质量变化、病理改变、MTB负荷等角度评价维生素D在结核病中的辅助治疗作用。豚鼠对MTB高度敏感，低剂量MTB就能使豚鼠发展成与人类相似的结构典型的肉芽肿，可发展为坏死，且肉芽肿内含菌量低，与人体感染MTB一样可造成相似的病理损伤；豚鼠模型存活率高。感染初期表现为CD4为主的强烈的细胞反应，而在感染30 d后表现为B细胞和粒细胞稳定增加[27]，提示豚鼠建立了稳定的免疫反应，此时与人体感染MTB时的免疫状态相一致。本研究模拟人体感染与发病的方式：以气溶胶方式感染豚鼠，在感染4周后建立豚鼠慢性结核病模型，开始药物干预性试验。

本研究中将异烟肼和利福平的剂量设定为10 mg/kg，依据文献[12]，在阳光充足的条件下，人体每天合成的维生素D可达到10 000～25 000 IU，而每天补充10 000～50 000 IU维生素D是安全的；另根据Daley等[7]研究中高剂量维生素D给药方式为100 000 IU，隔周1次，据此本研究设定了2种补充维生素D的方式：每日常规剂量(10 000 IU，1次/d)和单次高剂量(100 000 IU，隔周1次)。在豚鼠慢性结核病模型中分4周和8周2个时间点评价了维生素D的辅助治疗作用。笔者观察到单独补充维生素D未减轻豚鼠的MTB负荷，也未减轻病理损伤，而异烟肼-利福平化疗辅以单次高剂量维生素D隔周给药，治疗4周后肺脏和脾脏活菌计数较单纯化疗分别下降了0.59和1.72 lgCFU，治疗8周后肺脏和脾脏活菌计数较H-R组分别下降了0.52和2.26 lgCFU；异烟肼-利福平化疗辅以每日常规剂量维生素D治疗4周后脾脏活菌计数较单纯化疗组下降了1.66 lgCFU；在辅以单次高剂量维生素D隔周给药4周后脾脏病理改变轻于单独化疗组，治疗8周后肺脏病理改变轻于单独化疗组，显示维生素D在豚鼠结核病中具有一定的辅助治疗作用，预示临床应用可能在改变患者症状上有一定的作用和价值。

本研究存在以下不足：豚鼠体型较大、生长快，且个体间差异明显，体质量和脏器质量也表现出较大差异，需要增大实验动物数量才能得出更有力的结论；未能测定豚鼠血浆维生素D浓度是本研究的不足；本研究仅选取了2种补充维生素D的方式进行试验，并未对维生素D的补充剂量进行探讨，此外有研究报道了补充高剂量维生素D(60 000 IU，每周1次或600 000 IU单次给药)的5例肉芽肿性疾病患者均发生了高钙血症，其中有2例患者为结核病[28]，故维生素D最佳的补充剂量仍需进一步研究探讨。最后，维生素D如何在豚鼠结核病模型中发挥免疫调节作用的机制仍存在争议，有研究发现维生素D并非抑制Th1细胞分化而起免疫抑制作用[29]，探索维生素D的免疫调节作用需要进行更深入的研究。

本研究是对豚鼠结核病模型中维生素D具有一定的辅助治疗作用的首次报道，给维生素D在临床的应用带来新的希望。有必要对维生素D开展进一步研究，以发现和揭示其保护作用机制，为在结核病治疗中的应用提供充分依据。

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