独家能 聂春霞 许雯雯 刘聪 康永 倪艳 郝旭亮

[摘要] 目的 探討柴欢宁神颗粒对多因素复合法致肝郁失眠证候模型大鼠的行为学和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的影响。 方法 将70只SD大鼠雌雄各半，随机分为空白组，模型组，柴欢宁神颗粒高、中、低剂量组（2.25、1.125、0.5625 g/kg），解郁安神组（1.25 g/kg），艾司唑仑组（0.5 mg/kg）。除空白组外，其余各组均采用束缚+夹尾刺激+PCPA多因素制备肝郁失眠证候的大鼠模型。各给药组经灌胃给予相应的药物，空白组及模型组给予等体积的生理盐水，每日1次，连续14 d。分别于实验第0、7、14、21天测试各组大鼠的体重、糖水消耗量、睡眠状况及水迷宫定位航行和空间搜索能力等指标评价大鼠的行为学。后采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠下丘脑中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、血浆促肾上腺皮质激素（ACTH）和血清皮质醇（CORT）水平。 结果 与空白组比较，模型组大鼠体重、糖水消耗量、睡眠时间、空间搜索能力明显降低，下丘脑CRH、血浆ACTH、血清CORT及水迷宫定位航行时间升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。经给药干预后，与模型组比较，各给药组可增加大鼠的体重、睡眠时间、糖水消耗量、穿越平台的次数，同时降低大鼠下丘脑CRH、血浆ACTH、血清CORT的水平，以及定位航行的时间，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 柴欢宁神颗粒可明显改善肝郁失眠证候模型大鼠的行为学，延长睡眠时间，其机制可能与调节改善HPA轴功能的亢进有关。

[关键词] 柴欢宁神颗粒；肝郁失眠；下丘脑-垂体-肾上腺轴；作用机制

[中图分类号] R256.23 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（b）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Chaihuan Ningshen Granules on the behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal （HPA） axis of rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi induced by multifactor combination therapy. Methods Seventy SD rats （half male and half female） were randomly divided into 7 groups： blank group， model group， high， medium and low dose of Chaihuan Ningshen Granules groups （2.25， 1.125， 0.5625 g/kg）， Jieyu Anshen Granules group （1.25 g/kg）， Estazolam group （0.5 mg/kg）. Except for the blank group， rats in each group were established for the model with syndrome of stagnation of liver qi by multifactorial stimulation including tie， pinch-tail and PCPA. Each administration group was treated daily with an oral infusion of corresponding drug， whereas， the blank group and the model group were given equal volume of saline once a day for 14 days. All rats were tested on the 0， 7th， 14th， 21st d for body weight， sugar consumption， sleep status， water maze navigation and spatial search ability to evaluate the behavior of rats， The levels of corticotropin-releasing hormone （CRH）， adrenocorticotropic hormone （ACTH） and serum cortisol （CORT） in the hypothalamus of rats were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with blank group， the body weight， sugar consumption， sleep duration and spatial search ability of the model group were significantly decreased， while the hypothalamic CRH， plasma ACTH， serum CORT and water maze positioning sailing time were markedly increased （P < 0.05）. Compared with the model group， all medicine groups could significantly increase body weight， sleep duration， consumption of sugar water and the number of crossing platform （P < 0.05）， meanwhile decrease the levels of the hypothalamic CRH， plasma ACTH and serum CORT， as well as water maze positioning sailing time， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Chaihuan Ningshen Granules can remarkably improve the behavior of rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi， and prolong their sleep time， the mechanism underlying this event is mainly dependent on the improvement effect of Chaihuan Ningshen Granules on the function of HPA axis.

[Key words] Chaihuan Ningshen Granules； Insomnia with syndrome of stagnation of liver qi； Hypothalamic-pituitary-adrenal axis； Mechanism

失眠是临床上最为常见的一种生理、心理疾病，指入睡困难或睡眠质量差，给人们的正常工作和生活带来严重的不良影响[1-2]。其中，在失眠患者中，肝郁引起的失眠所占比重较大[3]。柴欢宁神颗粒是山西省中医院调节改善肝郁失眠的常用制剂，组方由柴胡、黄芩、党参、大黄等14味药构成，具有调和阴阳、宣畅化郁、重镇安神之功，多年的临床应用对于肝郁失眠有一定的疗效，但目前对其治疗的具体作用机制尚不明确。因此本研究采用多因素复合法制备肝郁失眠的模型，进一步观察柴欢宁神颗粒对模型大鼠行为学，及对血浆促肾上腺皮质激素（ACTH）、血清皮质醇（CORT）和下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的影响，从而探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6周龄SD大鼠雌雄各半，体重（200±20）g，购自中国食品药品检定研究院，合格证号SCXK（京）2014-0013。大鼠饲养于山西省中医药研究院中药方剂研究所药理动物室，每笼5～6只，饲养温度21～24℃，相对湿度18%～22%，12/12明暗交替，期间自由摄食、饮水，以普通饲料喂养。

1.2 药物与试剂

柴欢宁神颗粒（山西千汇药业有限公司，批号：20170801）；解郁安神颗粒（河南辅仁堂制药有限公司，批号：20161202）；艾司唑仑（山东信谊制药有限公司，批号：170407）；对氯苯丙氨酸（PCPA）（美国SIGMA-ALDRICH公司，批号：SHBG8045V）；CRH试剂盒（上海优仟生物科技有限公司，批号：2017110）；ACTH试剂盒（上海优仟生物科技有限公司，批号：20171101）；CORT试剂盒（上海优仟生物科技有限公司，批号：20171020）。

PCPA的溶解：将PCPA充分研磨，加入生理盐水，后滴加几滴吐温80助溶，继续研磨，直至达到基本混溶，临用时配成40 mg/mL混悬液。

1.3 实验仪器

KDC-2046低速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；Morris水迷宫视频跟踪系统（成都泰盟科技有限公司）；IXA-T25数显高速离心机；Lenovo电脑；摄像头；OFT-100开场实验视频分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与给药 实验当日，依据OFT-100开场实验对大鼠行为学测试的结果，选取活动次数相近的SD大鼠，依照体重随机分为空白组，模型组，柴欢宁神颗粒高、中、低剂量组，解郁安神组，艾司唑仑组，每组10只。空白组与模型组每天灌胃给予等体积量的生理盐水。柴欢宁神颗粒高、中、低剂量组（2.25、1.125、0.5625 g/kg），解郁安神组（1.25 g/kg），艾司唑仑组（0.5 mg/kg），以上各组均按大鼠1 mL/100 g配置成相同的水溶液，灌胃给药。于刺激第7天后，造模的同时开始灌胃给药，每日1次，连续14 d[4]。

1.4.2 模型制备 参照文献[5-6]的方法，并加以改进，进行肝郁失眠模型的建立。适应性喂养结束后，分组每笼5～6只饲养，空白组大鼠无任何外加刺激，其他组分别用医用胶带将其前肢束缚，使其活动受限，并坚持每天用尖端包裹海绵的止血钳夹大鼠尾部（离近端1/3处），每只5 min，令其处于打斗状态，以不破皮流血为度，连续21 d，并在造模第14天后，注射40 mg/mL的PCPA，连续2 d。根据肝郁失眠证候文献建立本研究造模成功的标准[7]：①实验动物体重下降，饮食活动量明显减少。②体毛凌乱无华，精神萎靡，以圈缩为主。③睡眠节律紊乱，时长下降。④再次刺激时，反抗明显下降，低落。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠一般状态及总睡眠量 从实验开始，分别记录实验第0、7、14、21天各组大鼠一般状态的特征，包括精神状态、活动、毛发、饮食及排泄等指标，并通过监控摄像系统记录观察各组大鼠的睡眠时间。

1.5.2 糖水实验 实验第0、6、13、20天分别禁水不禁食24 h，次日给予1%的蔗糖水，分别测试大鼠5 h糖水消耗量。

1.5.3 Morris水迷宫实验 实验中水深约30 cm，水温控制在24℃左右，将各组大鼠面壁从固定的位置放入水中（第二象限标记处），仪器追踪录像系统自动追踪记录大鼠潜伏期（大鼠完全爬上平台并停留2 s），如果大鼠在2 min内未找到平台，将其引至平台[8]。从造模第14天开始训练，1次/d，连续5 d，选取最后2 d的成绩平均值为最终的定位航行成绩。第6天撤去水中的平台，记录大鼠2 min中内穿越原平台的次数，分别作为评价大鼠成绩的指标[9]。

1.5.4 大鼠下丘脑CRH、血浆ACTH、血清CORT含量检测 各行为学实验考察结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脉取血，一部分放入抗凝管中，一部分置于EP管中，后迅速断头，置于冰袋上取出下丘脑等脑组织，放置液氮罐中，最后存放于-80℃冰箱中备用；将血清、血浆静置30 min后，4℃，3000 r/min离心（离心半径为16 cm），取上清液，于-20℃存放，照试剂盒说明，分别进行下丘脑CRH、血浆ACTH、血清CORT的检测。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对原始数据进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用One-way ANOVA单因素方差分析，两两组间比较，方差齐则采用LSD法，方差不齐采用Dunnett-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组间大鼠宏观体表特征及睡眠量

实验前各组大鼠毛色光亮、活动灵敏，精神状态良好，睡眠正常；实验刺激第7天时，除空白组外，其余各组大鼠毛色明显灰暗，行动迟缓，大多弓背贴壁行走，叫声变尖细，组内打斗明显，胡须下垂，大多表现为聚积奢睡，且大便开始不成形；14 d时，模型组大鼠毛发明显凌乱，夹尾刺激反抗低落，大便溏薄稀，大多弓缩在角落，体重与空白组比较明显下降（P < 0.05），与给药组比较差异也有统计学意义（P < 0.05）（图1）；21 d时，模型组大鼠精神明显萎靡，全部弓缩在角落，体重与给药组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）（图1），且通过摄像记录系统观察到模型组大鼠睡眠节律紊乱，总睡眠量明显减少，与空白组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01），而给药组状态明显好转，毛色有光泽，睡眠时间较模型组明显延长，与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）（图2）。实验过程中模型组大鼠死亡1只（可能注射PCPA导致）。

2.2 对肝郁失眠模型大鼠糖水偏爱度的影响

在大鼠接受7、14、21 d刺激后，与空白组比较，模型组大鼠糖水的偏爱度明显下降（P < 0.05或P < 0.01）；实验第21天时，与模型组比较，各给药组大鼠對糖水的偏爱度均明显增加（P < 0.05），尤以艾司唑仑组明显（P < 0.01）。见表1。

2.3 对肝郁失眠模型大鼠水迷宫定位航行及空间搜索的影响

与空白组比较，模型组大鼠定位航行时间明显延长（P < 0.01），穿台次数显著减少（P < 0.05）；与模型组比较，各给药组均较明显缩短了其定位航行的时间，且增加了穿越平台的次数，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.4 对肝郁失眠模型大鼠下丘脑CRH、血浆ACTH、血清CORT的影响

与空白组比较，模型组下丘脑CRH、血浆ACTH、血清CORT的含量均明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。与模型组比较，各给药组均对上述指标有明显改善（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

3 讨论

随着社会、生活等各方面压力的增加，肝郁化火、肝郁气滞已成为引起失眠的主要病机，大多表现为心烦怒燥、胸闷胀痛、舌红、苔黄等[10]。柴欢宁神颗粒以柴胡、黄芩、大黄为君药，配伍党参等14味药组方，能调阴阳、散肝郁、安心神，故为治疗肝郁化火兼有痰热的良方，并被临床广泛应用所证明。本研究采用大鼠束缚+夹尾刺激+PCPA的多因素复合法制备大鼠肝郁失眠证候的动物模型，并从实验药效学的角度对其进行了科学论证。

目前研究已表明[11-12]：长期慢性的束缚与夹尾刺激可使大鼠出现诸如胡须下垂、弓背贴壁行走、饮食减少、叫声尖细等情绪低落的表征。这种表现基本符合情感不舒，郁怒藏抑于体内，肝气郁滞，而导致的“肝郁”证候。而中医理论中“肝主藏血”，肝郁久而化热，耗费阴血而致血不养心，进而神魂不宁、虚烦不眠。 因此本研究在“肝郁”的基础上，进一步腹腔注射PCPA，耗竭大鼠体内5-HT，大鼠出现明显昼夜节律紊乱、躁动不安、昼夜不寐的现象，从而科学模拟肝郁失眠的大鼠模型[13]。目前已有众多的文献表明，采用此种方法可以较好地建立肝郁失眠的大鼠模型[14-15]。在对大鼠施加3周的刺激进行造模后，分析大鼠的体重、糖水消耗、水迷宫学习记忆能力等行为活动为测试指标。本研究结果显示，与空白组对比，模型组各项指标均显著降低（P < 0.05），说明动物模型的建立可信、可靠。临床肝郁失眠患者情绪低落，昼夜不寐，次日精神萎靡，渐之身体消瘦，影响正常工作生活。这与模型动物体重、糖水的喜好度、记忆力下降、睡眠节律紊乱、总睡眠量减少等特征表现相类似。因此对于柴欢宁神颗粒治疗肝郁失眠大鼠模型的研究，可以较好地明确其疗效和初步的作用机制，并且通过阳性药物解郁安神颗粒和艾司唑仑的正向对比，可以更加充分地表明其确切的作用效果，增加实验的严谨性、科学性。

现代研究表明，HPA轴系统与睡眠-觉醒规律之间存在着密切的联系，HPA轴功能紊乱，睡眠-觉醒规律失常，最终导致失眠的发生[16-17]。HPA轴作为机体最重要的应激反应轴，其中对睡眠的调节起着举足轻重的作用[18-19]。长期的刺激会导致反应中枢HPA轴的功能亢进，激活脑部的杏仁核组织，增加CRH的分泌与释放，起到增加觉醒和减少睡眠的作用[20-21]。实验结果显示，模型组大鼠下丘脑CRH、血浆ACTH和血清CORT均明显升高，推测肝郁证候造成的失眠与上述指标紊乱有密切关系。这可能是HPA轴过度活化，持续促使刺激CRH和CORT分泌，使机体处于持续兴奋状态而导致失眠。

本研究从宏观和微观两种角度对模型组与柴欢宁神颗粒组及解郁安神组、艾司唑仑组进行了评价研究。在宏观上，通过对大鼠毛色、体重、糖水消耗以及睡眠状况的摄像系统观察，研究结果提示，柴欢宁神颗粒可以显著改善模型大鼠的行为学及睡眠的时间；在微观上，对下丘脑CRH、血浆ACTH和血清CORT等HPA 轴相关指标进行了全面的检测，结果显示，模型组上述指标均显著升高，同时给药组可以逆转上述指标的升高，最终结果与模型组比较有显著差异，提示柴欢宁神颗粒对模型大鼠的作用效果显著。

综上所述，柴欢宁神颗粒能够明显改善肝郁失眠模型大鼠行为学，并明显增加大鼠体重，延长睡眠的时间，其作用机制与改善HPA轴功能激进有一定的关系，但具体的作用过程还有待深入探讨。

[参考文献]

[1] 程国良，钱彦方，李静，等.失眠机制研究进展[J].世界睡眠医学杂志，2016，3（3）：174-179.

[2] 黎发根，李绍旦，杨明会.中医药治疗失眠症作用机理研究进展[J].环球中医药，2012，5（7）：543-546.

[3] 郑舒月，王媛媛，彭浩轩，等.中医药治疗肝郁化火型失眠的研究进展[J].医学综述，2017，23（13）：2662-2665， 2670.

[4] 朱洁，申国明，汪远金，等.肝郁证失眠大鼠模型的建立與评价[J].中医杂志，2011，52（8）：689-692.

[5] 游秋云，王平，吴丽丽，等.舒郁安神方对老年肝郁失眠证候模型大鼠学习记忆及脑组织谷氨酸、γ-氨基丁酸含量的影响[J].中国老年学杂志，2011，31（6）：1006-1009.

[6] 肖成荣，马增春，李海静，等.PCPA失眠大鼠模型的制作及其机制[J].毒理学杂志，2007（4）：326.

[7] 游秋云，王平，田代志，等.老年肝郁失眠证候大鼠模型的建立和评价[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（2）：222-225.

[8] 王俊亚，张冬梅.Morris水迷宫实验的测试方法介绍及注意事项[J].现代医药卫生，2012，28（21）：3289-3290.

[9] 闫盼盼，闫国立，詹向红，等.Morris水迷宫实验设计的统计学方法探析[J].中华中医药学刊，2013，31（2）：264-266.

[10] 李国师.肝郁化火型失眠的病机及治法研究[D].广州：广州中医药大学，2014.

[11] 吴丽丽.老年肝郁失眠大鼠模型的建立及舒郁安神方作用的研究[D].武汉：湖北中医学院，2008.

[12] 路腾飞，于泽胜，姚璐，等.柴胡白芍药对对慢性温和不可预知性应激抑郁模型大鼠行为学的影响[J].中草药，2016，47（12）：2137-2141.

[13] 顾思臻，窦丹波.中医中药对PCPA失眠大鼠模型HPA轴相关单胺类神经递质及激素影响的研究进展[J].上海中医药大学学报，2015，29（1）：83-86.

[14] 游秋云，王平，田代志，等.老年肝郁失眠证候大鼠模型的建立和评价[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（2）：222-225.

[15] 金光亮，南睿，郭霞珍.慢性应激肝郁证大鼠模型的建立[J].北京中医药大学学报，2003，26（2）：18-21.

[16] 许峰.基于5HT_（1a）、5HT_（2a）、DD2受体系统及HPA轴的“熟眠方”治疗失眠机制研究[D].长春：长春中医药大学，2014.

[17] 王晓滨，许瑞，孔明月，等.柴胡加龙骨牡蛎汤对慢性应激抑郁大鼠强迫游泳行为及HPA轴的影响[J].哈尔滨医科大学学报，2014，48（3）：198-201.

[18] Thomson F，Craighead M. Innovative approaes for the treatment of depression：targeting the HPA axis [J]. Neunoem Res，2008，33（4）：691-707.

[19] 李慧，刘淑莹，王冰.人参皂苷对HPA轴作用的研究进展[J].药学学报，2014，49（5）：569-575.

[20] Huang Z，Liang P，Jia X，et al. Abnormal amygdala connectivity in patients with primary insomnia：evidence from resting state fMRI [J]. Eur J Radiol，2012，81（6）：1288-1295.

[21] 李一瀛，胡珍真，黄志力，等.应激在抑郁症失眠中的作用和常用应激动物模型的睡眠特点[J].药学学报，2012， 47（1）：1-6.