孙明波 李勇 刘赞 陈文博 辽宁省医疗器械检验检测院 （辽宁 沈阳 110179）

壳聚糖是一种甲壳素经过脱乙酰化处理后的高分子聚合物，具有抑菌、抗肿瘤、促进血液凝固等药理学活性，在自然界中资源丰富、无毒，具有良好的生物相容性和生物可降解性，近年来，在妇科产品中的应用越来越多，如壳聚糖妇科栓剂、壳聚糖宫颈抗菌膜等[1]。目前，市售阴道、尿道给药制剂多为要求控制微生物限度，要求无菌的较为少见，如何针对壳聚糖妇用抗菌栓的抗菌活性，建立快速有效的无菌检查法的详细报道更为少见，本文结合执行2015年版《中国药典》，建立了壳聚糖妇用抗菌栓无菌检查的方法。

1.资料与方法

1.1 临床资料

仪器：集菌仪（HTY-2000A）（杭州高得医疗器械有限公司）；一次性全封闭集菌器（杭州泰林生物技术设备有限公司）；生物安全柜（HFsafe-1200）（上海力申科学仪器有限公司）。

供试品：壳聚糖妇用抗菌栓，规格：1.8g，批号：20161101，由企业提供。

实验菌种：大肠埃希菌[CMCC(F)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均来自中国药品生物制品检定研究院医学菌种保藏中心。

培养基及试剂：硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂（Merck公司）均通过培养基灵敏度的检查；蛋白胨（北京索莱宝科技有限公司）；吐温80（国药集团化学试剂有限公司）；0.9%无菌氯化钠溶液（沈阳志鹰药业有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备[2]

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35˚C培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25˚C培养24～48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数＜100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25˚C培养5～7d，加入3～5mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数＜100cfu的孢子悬液。

1.2.2 方法验证

直接接种法：取硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入＜100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管，取胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入＜100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入供试品1粒，另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5d。

薄膜过滤法：取供试品5粒（每种试验菌的样品量），投入到45˚C含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL，置恒温振荡器中震荡使其溶解[3,4]。采用薄膜过滤法，趁热将45˚C水浴的供试品进行薄膜过滤，冲洗，总冲洗量500mL，每次100mL，冲洗液为45˚C含1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液，最后一次冲洗液中加入＜100cfu的试验菌。另取一装有同体积相同培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照，按规定温度培养3～5d。各试验菌同法操作，并分别做阴性对照。

1.2.3 供试品的无菌检查

取供试品15粒，投入到45˚C含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300mL，置恒温振荡器中震荡使其溶解，作为供试液。采用薄膜过滤法（一次性全封闭集菌器，3筒/联），趁热将45˚C水浴的供试品进行薄膜过滤，冲洗，总冲洗量分别为500mL，每次100mL，冲洗液为45˚C含1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液，阳性对照在最后一次冲洗液中加入＜100cfu的试验菌。按规定温度培养14d，逐日观察。

2.结果

2.1 直接接种法验证结果

由于栓剂剂型的特殊性质，直接接种法不能使供试品内的内容物全部释放，且供试品的性状会影响结果的观察，无法判断结果，故不适用。

2.2 薄膜过滤法验证结果

薄膜过滤法方法学验证结果见表1。从表1可以看出，供试品组与阳性对照组均生长良好，用45˚C含1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液冲洗薄膜过滤器时，供试品对6株阳性菌无抑菌作用，可进行供试品的无菌检查。

2.3 供试品的无菌检查

由表2可知，供试品管与阴性管均澄清，阳性管生长良好，供试品符合规定。

表1. 壳聚糖妇用抗菌栓的方法验证结果

表2. 供试品无菌检查结果

3.讨论

壳聚糖具体的抗菌机制目前尚未清楚，但有许多较为合理的抗菌机制。郑连英等[5]认为其抗菌作用主要有以下两种机制：一种是形成一层高分子膜，阻止营养物质的运输；另一种是渗透进细胞内，发生絮凝作用。宋献周等人认为其抗菌机制为通过某种途径进入菌体细胞内并扰乱其生理代谢实现的[6]。

随着2015版药典的发布，微生物的检验标准有了新的提高，我国药品、医疗器械的微生物检验控制体系与国际通行标准全面接轨，由于药品、医疗器械品种的多样化、复杂化，无菌检查的方法学建立是十分必要的。

[1] 马军阳,陈亦平,李俊杰,等.甲壳素/壳聚糖止血机理及应用[J].北京生物医学工程,2007,26(4):442-444.

[2] 国家药典委员会.中国药典[M].中国医药科技出版社,四部.2015:1107.

[3] 张亚茹,陈莉莉,曹佳茜,等.克霉唑栓微生物限度检查方法的验证[J].实用药物与临床,2015,18(5):587-590,631.

[4] 檀巧婷,严佳,钟桂香,等.硝酸甘油软膏的无菌检查方法学验证[J].药学实践杂志,2015,33(3):253-254.

[5] 郑连英,朱江峰,孙昆山.壳聚糖的抗菌性能研究[J].材料科学与工程,2000,18(2):22-24.

[6] 宋献周,沈月新.不同平均分子量的α—壳聚糖的抑菌作用[J].上海水产大学学报,2000,9(2):138-141.