杨俊

广东美味鲜调味食品公司，广东中山，528400

引言

酱油是我国的传统发酵调味品，由于其浓烈的鲜味、色泽以及丰富的营养价值，广泛应用于人民饮食生活中不可或缺的调味品。根据原料可以区分两种酱油：我国生产的酱油以大豆为主，日式酱油以等量的大豆和小麦制成。中国式酱油在中国，印度尼西亚，马来西亚，菲律宾，新加坡，泰国等亚洲地区占主导地位，而日本式在日本和西方国家更受欢迎[1]。

酱油生产分为两步发酵过程：制曲和发酵，在日式中，通过在等量的熟大豆和小麦粉混合物上生长米曲霉等米曲霉，然后通过将所得曲与含有18-22%NaCl的盐水溶液混合进行发酵来制备日本式。我国酱油的生产普遍采用米曲霉沪酿3.042纯菌种制曲，并且高盐稀态发酵相对于低盐固态发酵，能够在工艺上提高酱油品质，采用单菌种制曲或者多菌制曲[2]。香气作为一种体现酱油风味特征的重要元素，尽管在酱油组分中的含量甚微，但其成分极为复杂，对酱油风味的影响极大。传统发酵过程中的阶段是非常关键的，因为在这个阶段产生了关键的挥发性化合物，味道活泼的氨基酸和肽，以及有助于最终调味酱的糖。乳酸菌嗜盐四联球菌和酵母鲁氏接合酵母构成驱动发酵的核心微生物复合物，不管酱油的来源和生产过程如何，因此微生物种类的增殖顺序和它们的平衡非常重要[3]。通过乳酸和酒精发酵分别产生了丰富的由嗜盐乳杆菌和鲁氏乳杆菌产生的次级代谢产物，它们负责最终产品的风味[4]。酱油中重要的芳香化合物，如乙酸，甲酸，苯甲醛，乙酸甲酯，2-羟基丙酸乙酯，2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛是由T. halophilus产生。此外，Z.rouxii在乙醇，高级醇和4-羟基-2（或5）-乙基-5（或2）-甲基-3（2H）-呋喃酮的形成中起重要作用（HEMF），这对于最终产品的特征风味是必不可少的[5][6][7][8]。

本研究采用米曲霉制曲，以嗜盐四联球菌9477和鲁氏接合酵母1682不同次顺接种发酵考察对酱油风味的影响。

1. 材料与方法

1.1 试验菌种

米曲霉制曲，以嗜盐四联球菌9477(T.haloophilus)和鲁氏接合酵母1682(Z.rouxii)

1.2 试验原料

大豆粉，小麦粉和氯化钠（NaCl，超纯），

1.3 制曲

将大豆粉和小麦粉在121℃下灭菌15分钟。 将100克大豆粉与120毫升无菌蒸馏水混合，维持大豆粉的水分。将煮熟的大豆粉冷却至室温，然后与小麦粉彻底混合（1：1w/w）。用米曲霉孢子接种混合物至终浓度为105个孢子/g底物。

1.4 豆酱发酵

作为对照，（ii）用嗜盐假单胞菌接种，（iii）用Z.rouxii接种，（iv）与T.haloophilus和Z.rouxii共接种，和（v）用T.haloophilus接种，当pH下降到5.0时，然后依次接种Z.rouxii。接种后，将发酵液用涡旋匀浆并在30℃温育30天。在第0、5、10、15、20、25和30天采集样品。在补充有7%（w/v）NaCl和那他霉素的BHI琼脂上培养嗜盐粒细胞，同时完成Z.rouxii的细胞计数在YM琼脂上加入5%（w/v）NaCl和100mg/L氯霉素。

1.5 理化分析

在分析之前，将大豆发酵液样品在100℃处理2分钟，以防止发酵过程中产生的酶的测定干扰。 然后将样品在4℃以10000g离心10分钟。将视为生酱油的上清液转移至微管并保持在-20℃直至分析。使用酶分析试剂盒（Megazyme，International Ireland Ltd.，Inc。）分析总还原糖（葡萄糖和D-果糖），总乳酸（L-乳酸和D-乳酸），乙酸和乙醇。使用pH计监测pH的变化。

1.6 风味测定

对四种接种发酵的酱油30天结束后，利用气质色谱-质谱联用测定风味变化。

色谱条件：

色谱柱：DB-17MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm），采用自动进样。

进样口温度：250℃，载气为He，流速为 1.8mL/min，不分流进样。

程序升温：起始温度为40℃，保持3min后以4℃/min的速度升温至120℃，再以6℃/min的速度升温至240℃，保持9min。

质谱条件：

电子轰击电离（EI），电子能量为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为230℃，质量扫描范围为m/z=35～500。

2. 结果与分析

2.1 还原糖含量变化

对酱油发酵过程中，单独使用嗜盐四联球菌，单独接种鲁氏接合酵母，以及两者共同接种，先后接种对还原糖的影响如图1所示。

图1 还原糖含量变化图

在接种后5天，含Z.rouxii的所有模型中的还原糖含量下降到检测不到的水平，这种还原糖的消耗是由于酵母用于繁殖以及乙醇转化的糖利用，由于在发酵开始之前，酱醪中的米曲霉热灭活，所以霉菌不能再进行淀粉水解，导致Z. rouxii的还原糖的可用性降低。相比之下，在整个孵化期间，嗜酸乳杆菌的对照和单一培养物中还原糖的量仍然很高。在发酵结束时，分别在对照和单一培养物中发现了10.39g/L和10.42g/L的还原糖，分别比初始量高。这种增加可能是由米曲霉产生的淀粉酶的水解活性引起的，米曲霉在发酵期间保持活性[9][10]。用嗜盐菌处理的样品中更高量的还原糖也表明嗜盐菌属利用D-葡萄糖和D-果糖的能力有限。

2.2 乙醇含量变化

对酱油发酵过程中，单独使用嗜盐四联球菌，单独接种鲁氏接合酵母，以及两者共同接种，先后接种对乙醇的影响如图2所示。

图2 乙醇变化量

变化的还原糖含量与酱醪发酵过程中的乙醇产量有关，由于它是Z.rouxii生产的主要醇之一，所以监测乙醇在通过糖转化的盐水发酵过程中。在接种Z.rouxii后5天，所有含Z. rouxii的样品中的减少糖消耗与最大乙醇产量同时发生。正如预期的那样，在用单一的嗜盐菌和对照培养物处理的样品中未检测到乙醇[11][12][13]。因为还原糖含量保持稳定。一旦所有含Z. rouxii的样品中的糖耗尽，乙醇含量降至检测水平以下。

2.3 总乳酸、乙酸含量变化

对酱油发酵过程中，单独使用嗜盐四联球菌，单独接种鲁氏接合酵母，以及两者共同接种，先后接种对总乳酸的影响如图3所示。

图3 乳酸变化量

正如预期的那样，发现T.halophilus在乳酸和醋酸生产中起主要作用，令人惊讶的是，尽管T.halophilus生长得到增强，但当Z.rouxii存在时，两种酸的产生都受到抑制。在单一培养中，嗜酸乳杆菌能够产生乳酸和乙酸，最高水平分别为0.58g/L和0.26g/L，是所有样品中最高的。在整个发酵过程中，所有酱油样品中的氨基氮含量通常是恒定的并且有一些波动。氨基氮的变化可能是由于嗜盐嗜热菌或美拉德反应的代谢活性造成的，在酱油中形成深褐色的颜色。该反应涉及羰基化合物（例如还原糖和醛）与具有游离氨基的化合物的缩合。

图4 乙酸含量变化图

2.4 挥发性物质成分

对酱油发酵过程中，单独使用嗜盐四联球菌，单独接种鲁氏接合酵母，以及两者共同接种，先后接种发酵后，30天结束利用气相色谱质谱对其挥发性物质检测，检测结果如表1。

表1挥发性物质成分表(µg/ml)

在酱醪样品中共鉴定出23种主要的挥发性化合物，包括八种醇，三种酸，五种醛，两种酯，两种吡嗪，一种呋喃和两种酮，发现醇是所有酱油样品中检测到的最丰富的化合物，这与以前在高盐和低盐浓度下进行的研究一致。用Z.rouxii处理的酱醪中检测到总量较高的总醇化合物，作为单一或混合培养物，表明Z.rouxii主要负责醇形成。发现杂醇如苯乙醇（花香，甜味），3-甲基-1-丁醇（麦芽，酸败和辛辣）和2-甲基-1-丙醇（苦味）是最终的主要醇组分醪。还报道了通过添加在传统酱醪发酵期间从不同阶段分离的本地酵母，在还原盐酱醪中报道了高产量的上述杂醇。这些杂醇可能是由它们相应产生的[14]。

氨基酸通过Z. rouxii通过Ehrlich途径。酱醪发酵过程中存在的胞外氨基酸可通过Ehrlich途径发生脱氨基或转氨基，产生α-酮酸。α-酮酸作为形成杂醇的主要中间体。杂醇通过脱羧并随后还原相应的α-酮酸而形成[15][16]。与单一培养物相比，Z. rouxii和T. halophilus的组合显著增加3-辛醇（蘑菇样）生产。与单独培养和共培养相比，用连续接种处理的培养物中乙醇的获得量显得更低（p <0.05）。乙醇通常由葡萄糖通过糖酵解途径和厌氧发酵由Z.rouxii产生。在发酵开始之前，所有样品中都检测到其他醇类如2-呋喃甲醇（糖燃烧）和甲醇。所有样品都含有1-辛烯-3-醇（蘑菇样），但由于发酵期间的微生物活性，其量减少。尽管酱油中的大部分醇来源于糖和氨基酸的代谢，但酵母通过代谢相关的醛化合物也会产生少量的醇。醛类（糠醛，苯甲醛，2-甲基丙醛，3-甲基丙醛，3甲基丁醛和2-甲基丁醛）是大豆饲料中发现的第二大香味化合物。从发酵开始，它们就存在于大豆饲料中。然而，由于Z. rouxii的活性，其数量显著减少，尤其是混合培养[17]。这一假设得到了以下事实的支持：

Z.rouxii处理的样品比T. halophilus的对照和单一培养物高。这些醛对酱油麦芽和坚果香气影响较大。发现乙酸是嗜盐菌的单一培养物中的主要挥发物。与其他样品相比，其量显得（p <0.05），因为已知嗜盐菌已知产生乙酸。醋酸会给最终产品带来酸味。 生产3-甲基丁酸有利于嗜盐菌和鲁氏假单胞菌的单一培养。 据报道，它是我国酱油中的主要香味化合物，并且对强烈的刺激性，出汗和类似奶酪的气味产生影响。这种支链酸可能由Z. rouxii通过Ehrlich途径从大豆中所含的支链氨基酸生产。 混合培养物的存在似乎抑制了3-甲基丁酸的产生。在用Z.rouxii发酵的酱油样品中检测到包含乙酸异戊酯（香蕉香料）和乙酸2-苯基乙酯（蜂蜜，玫瑰色）的乙酸酯。混合培养物显著增加乙酸异戊酯的产量（p <0.05）。