姜竹茂，刘 晓,，张书文，逄晓阳，刘 鹭，芦 晶,*，吕加平,*

牛乳经过均质、灭菌、浓缩、喷雾干燥等工艺加工成乳粉，乳粉又可用作婴幼儿配方奶粉及其他食品配料[1]，在用作食品配料时（如制作配方奶粉、复原乳、酸奶等）将再次经过加热溶解、高温杀菌及喷雾干燥等多次热处理。热处理加工可杀灭牛乳中的微生物，保证牛乳质量安全，并使牛乳获得特殊风味[2]。另外，热处理会对牛乳品质造成不良影响，如牛乳中许多热敏营养成分会受到破坏，且随着受热强度的增加，牛乳会出现pH值降低、磷酸钙沉淀，蛋白质变性、维生素损失以及美拉德反应加剧[3]，影响牛乳的营养价值[4]。因而，引发了复原乳与鲜牛乳之争，如此对奶粉进行反复加热处理，对产品营养价值及食用品质到底产生了哪些影响，缺乏从微营养组及微观结构进行系统深入的比较研究。

与牛乳中的脂肪和碳水化合物相比，蛋白质对热处理更敏感，加热处理会造成乳蛋白变性或与碳水化合物等其他成分相互作用而发生成分结构和性质变化[5-6]。现已证实，热处理会导致牛乳蛋白质的消化性产生变化[7]。另外，蛋白质还可与乳中还原性糖发生美拉德反应，对牛乳的营养价值产生不良影响。为了研究热处理程度及加热次数对乳蛋白质的影响，本实验以鲜牛乳与复原乳为研究对象，通过加热或不加热处理后，对其进行蛋白质体外消化，然后采用电泳及组学等分析技术，对牛乳蛋白质的消化性、美拉德反应产物及程度进行研究，为乳品营养评价及优化加工工艺提供参考[8-10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛乳 北京三元集团下属奶牛场；乳粉市售；α-淀粉酶、溶菌酶、黏蛋白、牛血清蛋白、胃蛋白酶、胰液素、胆盐、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）美国Sigma公司；氯化钙、磷酸二氢钠、丙烯酰胺、过硫酸铵（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；四甲基乙二胺 美国AMResco公司；考马斯亮蓝R250北京广达恒益有限公司；蛋白质Marker 天根生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2300型紫外-可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司；TS-1脱色摇床 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；MVS-1旋涡混合器 北京金北德工贸有限责任公司；SC-15数控超级恒温槽 宁波新芝生物科技股份有限公司；3K-15离心机 美国Sigma公司；DELTA 320 pH计 瑞士梅特勒-托利多股份有限公司；BSA 124S-CW分析天平 上海精密科学仪器有限公司；EPS301电泳仪 美国GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

样品1鲜牛乳样品：购于牛场鲜牛乳，未经任何加工处理；样品2复原乳样品：乳粉用水溶解，使其蛋白质含量与鲜牛乳蛋白质含量相同；样品3加热鲜牛乳样品：鲜牛乳95 ℃，加热处理2 min；样品4加热复原乳样品：复原乳溶液95 ℃，加热处理2 min。

1.3.2 蛋白质含量的测定

参考GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》[11]。

1.3.3 体外模拟蛋白质消化[12]

1.3.3.1 消化液的配制

食物进入胃部后由胃蛋白酶将食物中的蛋白质分解成大肽段，进入小肠后，由胰腺分泌的胰蛋白酶分解成小分子肽和少量游离氨基酸。因此，体外模拟消化液主要分为唾液消化液、胃液、胰液及胆汁，各消化液组成见表1[13-15]。

表1 模拟消化液组分Table 1 Compositions of simulated digestive juices

1.3.3.2 体外模拟胃部消化

取热处理牛乳样品及未加工鲜牛乳各2.25 mL，加入唾液消化液3 mL，37 ℃保温5 min。然后取6 mL的胃液加入上述消化样品中，在37 ℃条件下振摇120 min。

1.3.3.3 体外模拟肠液消化

向胃消化后的样品同时加入6 mL的胰液和3 mL的胆汁，37 ℃振摇120 min。消化后的样品要尽快放入－80 ℃的冰箱冻存，以防样品变质，影响实验备用。

1.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）[16-17]

样品取自鲜牛乳、复原乳、热处理样品以及在胃液消化和肠液消化后的各个样品进行电泳，分离大于5 kDa的蛋白。使用12%分离胶。电泳所用Marker分子质量范围在14.4～94 kDa之间。

为了测定样品的蛋白含量，将样品稀释，最终确定所有的样品蛋白含量相同，与上样缓冲液等量混合，沸水浴3～5 min，离心2 min，取10 μL样品进行上样，电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝染色液进行染色1 h，再用脱色液进行脱色至条带清晰为止。

1.3.5 蛋白消化率的测定[18]

牛乳经过凝胶电泳后，测定各蛋白电泳条带灰度值，根据公式（1）计算蛋白消化率：

1.3.6 消化样品的肽段分布测定[19]

消化的样品用滤管离心过滤，经10 248 r/min离心30 min，取滤液，用尺寸排阻色谱柱分离，并进行分析，其中色谱标准品分子质量的选择要包含所有样品肽段的分子质量。BioBasic SEC-300色谱柱（7.8 mm×150 mm）；缓冲液A：50%水-50%乙腈-0.1%甲酸；流速0.5 mL/min，在波长214 nm处色谱分离并检测。

1.3.7 扫描电镜观察乳蛋白胶粒[20]

2 mL牛乳样品于10 ℃、5 000 r/min离心10 min脱脂。取500 μL脱脂后的牛乳样品与等体积的1.4%戊二醛溶液混合，混匀后在4 ℃的冰箱静置4～6 h。取1 mL的固定液用0.02 mol/L CaCl2溶液稀释到100 mL。将稀释后的样品涂抹在盖玻片上，滴加95%乙醇溶液脱水干燥，黏贴在金属台上喷金，用扫描电镜观察样品。

1.3.8 美拉德反应程度及反应产物[21]

取一定量的牛乳样品于10 ℃条件下5 000 r/min离心10 min脱脂，并测定蛋白浓度。

1.3.8.1 蛋白酶解反应

取含有1 mg蛋白的样品加入终浓度为5 mmol/L的DTT，56 ℃保温30 min；样品冷却后再加入终浓度为10 mmol/L的IAA（50 mmol/L NH4HCO3溶液），室温避光30 min；然后加入终浓度为5 mmol/L的DTT，室温避光15 min；样品反应完后按胰蛋白酶与蛋白质为1∶100的质量比加入胰蛋白酶，在37 ℃条件下消化4 h。最后加入10 倍稀释的三氟乙酸溶液若干，将该溶液的pH值调整为2.0即可，冷冻干燥。

1.3.8.2 糖蛋白富集反应

将1 mL间氨基苯硼酸琼脂糖装入层析柱中，用平衡液平衡层析柱。将600 μg酶解肽段溶于200 μL平衡液中，在4 ℃条件下加到层析柱中，静置1 h。用5 mL醋酸溶液洗脱糖基化肽段，分装为5 份，于－80 ℃冰箱中保存，待测。

1.3.8.3 质谱分析美拉德反应肽段

利用超高效液相色谱-二级质谱测定发生美拉德反应肽段。利用MaxQuant蛋白质组学分析软件解析发生美拉德反应的赖氨酸位点及其所在肽段和蛋白质。美拉德反应程度=美拉德反应肽段峰度值/样品测定肽段丰度总和。

1.3.9 糠氨酸含量的测定

根据NY/T 939—2005《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》的高效液相色谱法，在波长280 nm处对糠氨酸进行定性定量检测。流动相A为0.1%三氟乙酸溶液，流动相B为甲醇。洗脱条件如表2所示。

表2 高效液相色谱梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program of HPLC

糠氨酸含量按公式（2）计算：

式中：w为样品中每100 g蛋白质中糠氨酸的含量/（mg/100 g）；b为样品水解液中糠氨酸质量浓度/（μg/mL）；D为测定时样品稀释倍数（D=6）；m为样品水解液中蛋白质质量浓度/（mg/mL）。

标准曲线的测定：以糠氨酸标准样品配制成200 μg/mL的糠氨酸标准贮备液，然后配制成质量浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL的标准液，采用高效液相色谱测定其峰面积，并绘制标准曲线。将样品的峰面积代入标准曲线后，即可求得样品糠氨酸含量。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE测定结果

如图1所示，鲜牛乳、复原乳、加热鲜牛乳及加热复原乳4 个样品经过胃液消化后（A-2、B-2、C-2、D-2），其中鲜牛乳酪蛋白条带灰度值小于其他3 组样品，说明在4 组样品中鲜牛乳的酪蛋白于胃液中消化程度最高。而经胃液消化后β-乳球蛋白及α-乳白蛋白仍存在大量残留，说明在胃液消化阶段，仍有大量完整β-乳球蛋白及α-乳白蛋白未被消化。对比4 个样品的肠液消化样品（A-3、B-3、C-3、D-3），各样品的蛋白条带基本被消化完全，4 个样品间差异不明显。说明牛乳样品经过胃液后可消化部分蛋白，其中酪蛋白消化程度较大，而在肠液消化中，蛋白质基本消化完全。

2.2 不同消化阶段各样品蛋白质消化率

从图2A可以看出，经过胃液消化，鲜牛乳样品中酪蛋白的消化率最高，鲜牛乳中3 种酪蛋白均达到50%以上，且均显著高于其他3 个样品（P＜0.05）。鲜牛乳中β-乳球蛋白与α-乳白蛋白经胃液消化后，消化率较其他3 个样品低。由图2B可知，经过肠液消化后，蛋白质消化程度较胃消化阶段显著提高，特别是β-乳球蛋白与α-乳白蛋白，均被消化完全，且4 个样品无显著差异（P＞0.05）。

图2 不同热处理乳蛋白的胃消化率（A）和肠液消化率（B）Fig. 2 Gastric (A) and intestinal (B) digestibility of different heat-treated milk proteins

2.3 消化样品肽的分布

图3 不同热处理样品胃消化（A）和肠消化（B）后肽段分子质量Fig. 3 Molecular weight distribution of peptides in different heat-treated samples after intestinal digestion

根据肽段分子质量不同，利用体积排阻色谱法测定牛乳样品中肽段分子质量的分布情况[22-23]。由图3A可知，4 个样品经过胃液消化后，蛋白质在蛋白酶的作用下分解成大分子肽段和游离氨基酸，各样品肽段分子质量在6 000 Da以上的比例较大，其中在大于6 000 Da分子质量范围内，鲜牛乳胃消化样品中百分比显著低于其他3 个样品（P＜0.05）。说明胃消化后，鲜牛乳中的残留蛋白及大分子肽的含量较其他3 个样品少，消化效果优于其他3 组样品，此结果与电泳及消化率测定结果一致。由图3B可知，经过胃液消化的各组蛋白质样品再经肠液的进一步消化后的肽段分子质量主要在1 500 Da以内，主要集中在300～1 500 Da，即由大约2～12 个氨基酸组成的小分子肽段，而该分子质量大小的肽片段更容易被吸收[24]。但4 个样品在此分子质量区间肽段的分布比例彼此差异不显著（P＞0.05）。4 个样品肠液消化后在300～1 500 Da的肽段的含量较胃液消化阶段明显提高，说明肠道是蛋白质实现完全消化及吸收的主要阶段。

2.4 扫描电镜观察蛋白形态变化

图4 蛋白变化程度的扫描电镜图（×15 000）Fig. 4 SEM images of protein denaturation (× 15 000)

在相同倍数条件下扫描电镜观察4 种样品，如图4所示。与复原乳相比，鲜牛乳样品的蛋白质呈现分散状态，极少存在蛋白凝聚现象。鲜牛乳经加热后，蛋白质由于变性出现聚集，且不同样品的凝聚程度不同。4 个样品中，加热复原乳样品在电镜下蛋白粒径最大，4 种样品中凝聚程度最高。这是由于牛乳在加工成乳粉的过程中，需经过多次热处理，其热处理的次数与程度高于其他样品，变为复原乳后再经过热处理，蛋白变性程度较其他3 个样品高，蛋白凝聚形成较大的蛋白颗粒[25-26]，蛋白变性聚集成大颗粒团状也将抑制胃液对蛋白的消化效果。

2.5 热处理对糠氨酸含量的影响

图5 样品中糠氨酸的含量Fig. 5 Furosine contents in milk samples

如图5所示，鲜牛乳中糠氨酸含量显著低于其他3 个样品（P＜0.05）。鲜牛乳、加热鲜牛乳、复原乳及加热复原乳样品中糠氨酸含量依次增加，彼此差异显著（P＜0.05）。糠氨酸是美拉德反应初期的标志性产物[27]，其含量与美拉德反应的程度呈正相关，样品中糠氨酸含量越高，表明样品的美拉德反应程度较大[28]。与鲜牛乳相比，复原乳及加热复原乳因受到多次热处理，其蛋白质美拉德反应程度较大，糠氨酸含量也较高。

2.6 不同样品美拉德反应程度及反应肽段

利用超高效液相色谱-二级质谱联用技术分析乳中蛋白质发生美拉德反应位点及程度。4 种样品中发生美拉德反应的蛋白质主要为酪蛋白及α-乳白蛋白。如图6所示，加热复原乳的美拉德反应程度最高，其次是复原乳、加热鲜牛乳及鲜牛乳。与图5结果一致，说明热处理程度越大，乳蛋白发生美拉德反应程度越高。美拉德反应影响蛋白质赖氨酸的利用率同时影响功能性肽段的释放[29-30]。

图6 美拉德反应程度Fig. 6 Degree of Maillard reaction in milk samples

3 结 论

本实验从体外模拟蛋白消化、蛋白粒径及美拉德反应等方面进行研究。结果表明，经过胃液消化后，牛乳中部分蛋白被消化，其中酪蛋白消化较为明显，而肠液消化后，蛋白基本消化完全，说明主要消化场所在肠道中。鲜牛乳中酪蛋白在胃液中消化水平较其他热处理样品高。经过胃液消化后，大分子蛋白分解，生成6 000 Da以上的肽段，肠液消化后，大分子蛋白主要分解成小分子肽段及游离氨基酸，其肽段分子质量主要在300～1 500 Da之间。热处理过程使蛋白质发生聚集反应，热处理程度越大，蛋白粒径越大，说明温度越高，蛋白变性聚集，粒径越大。热处理使蛋白发生美拉德反应，温度越高，时间越长，美拉德反应越剧烈。

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