李洪果，贾宏炎，李武志，杜红岩，乌云塔娜，刘攀峰 ，包文泉

（1.中国林科院 热带林业实验中心，广西 凭祥 532600；2.国家林业局 泡桐研究开发中心，河南 郑州 450000）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我国特有的珍贵孑遗树种，雌雄异株，自成一科一属一种，在我国已有2000多年的栽培利用历史。杜仲是重要的国家战略资源，用途广泛，可作药用、材用、工业原料，亦可作食品原料、功能饲料等[1-4]。我国历史上对杜仲的引种和栽培利用一直在持续，新中国成立后，也经历了多次系统性的大规模引种，引种范围涵盖了我国绝大多数省区。近代以来，鉴于其胶原树种的特性和独特的分类学地位，世界上其他国家和地区也相继引种栽培，如日本、美国、韩国、欧洲等地。目前，99%以上的杜仲资源分布在我国，适生于广东韶关以北、吉林通化以南、新疆喀什以东、上海以西的27个省（区、市）。现有的杜仲群体均为人工栽培群体[5]，仅发现一株疑似野生的杜仲单株[6]。

遗传多样性是指一个种群内不同个体间或种内不同群体之间的遗传变异，是植物资源保护和利用的基础。了解植物群体的遗传多样性，掌握其影响因素和变化规律，确保遗传变异的持续存在和有效性对植物遗传多样性保护具有重要意义。SSR标记是多态性最高的遗传标记之一，其在杜仲遗传多样性分析上的有效性已得到广泛验证[7]。鉴于杜仲野生资源已基本消失，栽培利用正逐步向良种化方向发展[8]，一些栽培表现普通的杜仲单株及群体面临淘汰的压力，在这种情况下，如何保护杜仲遗传资源变得尤为迫切。中国林科院经济林研究开发中心数十年来从全国范围内收集了千余份杜仲种质资源，分析这些杜仲资源的遗传多样性和群体遗传结构，为更好更全面地研究、保护和利用杜仲种质资源提出有针对性的建议。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为以嫁接方式保存在河南原阳杜仲基因库内、群体内样本数量大于4的868份杜仲种质，种质来源及各群体的样本数见表1。实验材料涵盖了杜仲在国内的绝大多数分布区及部分早期引种至国外的样品，最大程度地包含了杜仲的遗传多样性类型。

1.2 DNA提取和SSR检测

DNA提取按照天根离心柱型植物DNA提取试剂盒说明书进行。获得的DNA浓度均≥50 ng/μL，OD260与OD280比值在1.8～2.2之间。引物合成及SSR检测由北京金唯智生物科技有限公司完成，引物信息见表2。PCR反应体系及反应条件参照吴敏的方法[9]。荧光PCR产物使用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测，经GeneMapper软件分析后，以PDF的形式呈现出毛细管电泳图。湖南江垭群体（22）中10003C种质基于引物GEU271的毛细管电泳检测结果见图1，表明扩增的目的片段清晰、准确、可靠。

表1 实验材料Table 1 Experimental materials

1.3 数据分析

利用GenAlex6.5软件计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon’s信息指数（I）、期望望杂合度（He）、观察杂合度（Ho）、固定系数（F）、基因流(Nm)和等位基因频率[10]。多态性信息含量 PIC（P）通过公式：P=1-Σfij2计算，其中fij为第i个位点第j个等位基因出现的频率[11]。利用Arlequin3.5软件进行分子方差分析（AMOVA）[12]。利用Popgene32软件计算群体间的遗传距离，基于UPGMA法生成聚类图。群体遗传结构由Structure2.3.4软件完成[13]。

表2 9对SSR引物信息Table 2 Information of nine pair of SSR primers

图1 湖南江垭群体10003C样品用GEU271引物PCR扩增的毛细管电泳检测结果Fig.1 Capillary electropherogram obtained by GEU271 primers of 10003C from Hunan Jiangya population

2 结果与分析

2.1 引物位点和群体的遗传多样性

9个SSR位点呈现出较高的多态性，结果见表3。9对基因组SSR引物共扩增出107个等位基因，各位点的等位基因数从7～15个不等，平均每个位点扩增出11.89个等位基因。9个SSR位点的Shannon’s信息指数（I）在1.242～1.675之间，平均为1.452；期望杂合度（He）在0.644～0.777之间，平均为0.713；观测杂合度（Ho）在0.379～0.762之间，平均为0.653；多态性信息含量（P）在0.712～0.848之间，均值为0.791；基因流（Nm）在1.473～3.002之间，平均为2.378。按P≥0.5的标准均为高多态性位点[11]，说明杜仲遗传多样性丰富。9个位点的基因流（Nm）均大于1，说明9个位点均能有效阻止遗传漂变等外力引起的遗传分化。

各个群体的遗传多样性结果见表4。由表4可知，杜仲群体的遗传多样性较高。42个群体的等位基因数（Na）在3.444～10.333之间，平均为5.823；有效等位基因数（Ne）在2.397～4.919之间，平均为3.809；Shannon信息指数（I）在0.952～1.762之间，平均为1.452；观测杂合度（Ho）在0.544～0.789之间，平均为0.653；期望杂合度（He）在0.511～0.748之间，平均为0.713。固定系数F为随机交配下群体内观测杂合度和期望杂合度的偏离值，用来衡量群体偏离哈迪-温伯格平衡的程度，参数的绝对值越大表明偏离哈迪温伯格平衡的程度越大。由表4可知，广东乐昌、贵州遵义、河南洛阳、湖南江垭、日本东京、浙江杭州群体偏离哈迪-温伯格平衡较多。另外，F＜0表示该群体在该位点杂合子缺失；F＞0表示杂合子过剩。河南三门峡、日本东京、日本岩手、山东青岛、新疆乌鲁木齐、云南盐津、重庆沙坪坝7个群体的F值小于0，表现为杂合子缺失，其余35个群体的F值大于0，表现为杂合子过剩。

表3 9个SSR位点的遗传多样性分析†Table 3 Genetic diversity analysis of nine pair of SSR locus

表4 42个杜仲群体的遗传多样性Table 4 Genetic diversity of 42 populations of E. ulmoides

2.2 杜仲群体的遗传结构

为了更好地研究杜仲资源的遗传组成与群体结构，应用Structure2.3.4软件对42个群体的868份杜仲种质资源进行遗传类群划分。设置K=1～43，Burin=100000，MCMC=100000，每个K值运行10次，以每个K值为横坐标，△K值为纵坐标，做折线图，结果如图2和3所示。由图2、3可知，K值确定为2，即将所有杜仲资源划分为2个类群，红色（黑色部分）为Ⅰ类群，包含28个群体；绿色（灰色部分）为Ⅱ类群，包含14个群体（见图3、4）。不同颜色代表不同的群体，该颜色所占的比例越大，则该资源被划分到相应群体的可能性越大。

图2 杜仲资源群体结构最优K值的确定Fig.2 Determination of the optimal value of K for population structure of E. ulmoides

图3 868份杜仲资源的群体遗传结构Fig. 3 Population structure of 868 E. ulmoides resources

图4 42个杜仲群体的遗传结构Fig.4 Genetic structure of 42 E. ulmoides populations

42个杜仲群体中，有35个群体既有红色基因占优的个体，又有绿色基因占优的个体，没有表现出明显的按地理来源的群体分类特征，即使是地理分布明显隔离的杜仲资源，也没有完全聚为一类，如新疆阿克苏（37）、云南盐津群体（40），说明杜仲群体间的交流较为频繁；甘肃康县群体（6）、江西九连山群体（26）、日本东京（28）、日本岩手群体（29）、陕西安康群体（32）、上海群体（34）和重庆沙坪坝群体（42）等7个群体的所有样品属于同一颜色的类群，表现出相对明显的地域性特征，同时也是基因池相对较纯的群体，说明这些群体受引种等人为因素干扰的情况相对较轻。

2.3 杜仲群体的聚类分析

将分子标记数据输入Popgene32软件，基于UPGMA法生成聚类图，结果见图5。聚类分析结果表明，42个群体很难再分出亚类，这与杜仲长期的引种栽培历史有关，其分布受人为因素影响较大。在最低分支上，可区分出中国群体和日本群体，但日本本土并无杜仲的天然分布，日本的杜仲资源系1899年前后从中国中部地区引种的种质，本质上属于中国中部地区的种质。因此，可以认为杜仲群体间遗传分化水平很低，尚未在遗传上分化出一个亚群体。结合群体遗传结构分析的结果，即最优分类群体数K=2，供试42个群体宜分为14个绿色基因占优的群体（图5有星标的群体）和28个红色基因占优的群体（图5无星标的群体）。绿色基因占优的14个群体，主要以6个河南群体为主，洛阳林科所群体是20世纪八九十年代从全国范围内收集的优树组成的群体，具体来源不详。根据史料记载的我国杜仲资源分布情况，杜仲的中心产区大致在陕南、豫西南、湘西北、川东北、滇东北、鄂西北、黔西北[5]。绿色群体中，河南三门峡群体的种质采自灵宝市，毗邻陕南地区，似可代表陕南地区的种质，河南洛阳、鹤壁、郑州、开封、商丘群体代表了豫西南的种质，云南盐津群体代表滇东北的种质，重庆沙坪坝代表川东北的种质，湖北武汉群体的样品来自武汉植物园，代表鄂西北的杜仲种质。因此，14个绿色群体可能更多反映了杜仲原生分布区种质的遗传信息；28个红色群体，包括2个日本群体，大多为引种栽培群体及其后代，可能更多反映的是引种区杜仲的遗传信息。总而言之，悠久广泛的引种栽培历史造成了现有杜仲资源难以考证种源的现实，供试868个样品42个群体的遗传结构和聚类分析结果可能更多反映的是当前杜仲资源分布区的杜仲遗传信息情况，并不能反映其在不同历史时期尤其是最初天然分布区的真实情况，对杜仲来说，以相同地理来源的材料总结该群体的遗传特征可能不是一个科学有效的策略。

2.4 杜仲群体的分子方差分析

为进一步了解杜仲群体间的遗传分化水平，对42个杜仲群体进行分子方差分析（ANOVA），结果（见表5）表明，杜仲的遗传变异主要存在于群体内，占93%，群体间的遗传变异仅占7%，说明杜仲群体间的相似程度高，这与杜仲群体聚类分析的结果相符，间接解释了杜仲群体难以区分出有规律的亚群现象。

表5 杜仲群体内和群体间的ANOVA分析Table 5 ANOVA results for within-and among-population variations in E. ulmoides

3 讨论与结论

图5 42个杜仲群体的聚类结果Fig.5 UPGMA clustering of 42 E. ulmoides populations

杜仲群体的遗传多样性水平较高。42个群体基于9对基因组SSR引物位点的观测杂合度在0.544～0.789之间，平均为0.653；期望杂合度在0.511～0.748之间，平均为0.713。高于黄海燕的研究结果：20个杜仲群体观测杂合度的范围为0.17～0.45，平均为0.29；期望杂合度的范围为0.25～0.43，平均为0.34[14]。也高于吴敏的研究结果：31个杜仲群体平均观察杂合度及平均期望杂合度分别为0.47和0.54[9]。杜仲较高的遗传多样性应是其适应性强、分布范围广、异交系统和种子繁殖的特点所致。试验中杜仲群体呈现出高于黄海燕、吴敏结果的遗传多样性水平也与扩增引物的有效性有关，黄海燕、吴敏分别设计合成了114对EST-SSR引物和290对G-SSR引物，从中选出26对高效引物，本实验在前两位研究者选用引物的基础上，再从26对高效引物中选择多态性高、重复性好的9对引物用于868份杜仲种质资源的遗传多样性分析。另外，本研究分析群体数和样本数分别为42、868，高于黄海燕的20个群体157份样品，也高于吴敏的31个群体342份样品，群体数、样本数的大量增加，也是研究结果呈现更高遗传多样性的原因。

杜仲分子方差分析的结果表明，杜仲遗传变异主要存在于群体内，约占93%，群体间的遗传变异仅占7%。这与吴敏的研究结果相同[9]：群体内变异占93%，群体间变异占7%。近似于黄海燕的研究结果：群体内变异占97.4%，群体间变异占2.6%[9,14]。与朱晓敏的研究结果不同：居群内占59.6%，群体间变异占40.4%[15]。与王瑷琦、糜亚男等的研究结论一致，即居群内存在较大的遗传多样性，居群间遗传多样性较低[16-17]。Structure2.3.4软件运算的结果表明，868份杜仲资源宜分为2个类群，即K=2，与黄海燕（K=6）和吴敏（K=7）的结果不同[9,14]，这可能与试验材料和群体数的大量增加有关。系统聚类的各种方法中，类平均法（UPGMA）兼具了灵敏性、真实性和单调性，是应用广泛、聚类效果较好的方法[18]。Popgene32软件基于UPGMA法的聚类分析表明，42个群体很难再区分出亚类，这一结果延续了黄海燕、吴敏的研究结果，即13对E-SSR引物无法明显区分20个杜仲群体，26对G-SSR引物无法有效区分31个杜仲群体，9对最高效的G-SSR引物无法区分42个群体，这说明杜仲群体间遗传相似性很高，不同群体间的遗传差异很小。不同软件由于内部算法不同可能会对研究结果产生一定的影响，因此，将42个群体的遗传相似系数再输入NTsys2.10e软件，采用UPGMA法聚类得到近似的聚类结果；采用最短距离法（Single）聚类时，42个群体逐步聚类，均无法有效地区分出亚类，这也间接反映了杜仲群体间遗传分化程度低、遗传变异小、种群间相似程度高的事实。杜仲群体间相似程度高、遗传分化程度低，可能与其孑遗植物的特点有关。孑遗植物的特点是：只存在于很小的范围内，所有近缘种已灭绝，孤立状态下进化缓慢。杜仲的异交系统、超强的适应性和人们不间断的引种栽培活动，也使得杜仲个体间的基因交流相对其他植物更为充分，有效抵御了隔离、自然选择、遗传漂变等引起的遗传分化。在进化缓慢而基因交流充分的前提（9个SSR位点的Nm值均＞1）下，供试群体在分子水平上表现出较高的相似性，难以再区分出具有明显特征的类群。

本研究基于SSR分子标记得到以下结论：杜仲群体的遗传多样性较高；杜仲在基因水平上的交流充分，所检测杜仲群体在9个基因组SSR位点上的基因交流未受到妨碍；杜仲群体间的遗传分化程度低，遗传变异小，种群间相似程度高，短期内不易发生居群分化形成亚种或地理小种；杜仲的遗传变异主要以群体内的变异为主，占93%，种群间的遗传变异占7%，保护杜仲的遗传多样性时，应保存尽可能多的种群和特异单株。然而，植物的表型变异往往是在内部的遗传变异与环境的相互作用下，由量变积累到质变的结果，SSR分子标记能检测整个DNA水平上种质材料之间的遗传差异，但不能反映基因与环境等因子之间的互作效应。Bhattacharjee等[19]发现基于形态标记和分子标记的遗传距离，两者仅存在很微弱的相关性（r=0.01）。González等[20]的研究也表明群体内分子标记和表型性状具有不同的变异模式，仅用分子标记信息不足以发现遗传资源的保护程序，而且基于分子标记进行群体的分类相对保守。可见，形态学差异和分子水平上的差异是相互独立的，所承受的进化压力和遵循的规律不同[21]。本研究分析了杜仲在分子水平上的遗传多样性和遗传结构，尚未就其在表型水平上的多样性进行研究，下一步将基于形态标记分析杜仲在表型变异上的多样性，获得更加全面的杜仲遗传多样性信息。

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