熊成文，李晓伟，徐得娟

（1.青海省食品检验检测院，青海西宁 810016；2.青海高远锦禾生态农牧科技有限公司，青海西宁 810016）

藜麦（Chenopodium quinoa）是南美洲安第斯山脉地区的重要作物[1]，藜麦籽实富含大量人体必需的维生素、氨基酸、矿物质、蛋白质和碳水化合物以及天然抗氧化物质，藜麦被联合国粮食及农业组织（FAO）评为21世纪具有保护粮食安全使命的作物之一[2-5]。藜麦籽实是黄酮化合物的良好来源，槲皮素和山柰酚是藜麦的主要黄酮化合物，而常见谷物如小麦、大麦和燕麦等不含有黄酮类化合物[6-8]。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎以及防癌抗癌的作用[9-11]，是对健康有益的成分，因此，藜麦可作为提高健康水平的生物活性物质的来源[12-13]。

本试验通过优化提取工艺，进行了方法学考察，建立了藜麦中槲皮素和山柰酚的HPLC测定方法，并对不同产地和不同加工方法的藜麦籽实中槲皮素和山柰酚的含量进行了比较，旨在为更好地评价藜麦的品质提供一种简便、可行、重复性好的质量控制方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂 供试样品藜麦为青藜一号，产自海拔3 100 m的青海省海西州都兰县香加乡，由青海高远锦禾生态农牧科技有限公司提供；槲皮素对照品，由上海金穗生物科技有限公司提供（批号20160709，含量≥98%）；山柰酚对照品，由上海金穗生物科技有限公司提供（批号20160817，含量≥98%）。甲醇为色谱纯，磷酸、盐酸等其他试剂均为分析纯，水为实验室三级用水。

1.1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪（Waters e2695，美国Waters公司），配有二极管阵列检测器（Waters 2996，美国 Waters公司），色谱工作站（Empower，美国Waters公司）。电子天平（FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-2，常州智博瑞仪器制造有限公司）；超声波清洗机（JP-030S，深圳市洁盟清洗设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 混合对照品溶液的制备 取槲皮素对照品20mg、山柰酚对照品10mg，精密称定，分别置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，再分别精密量取1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1 mL中含20 μg槲皮素和10 μg山柰酚的混合对照品溶液。

1.2.2 高效液相色谱分析条件 色谱柱采用Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（55∶45）；检测波长 360 nm；流速 1.0 mL/min；柱温 30 ℃；进样量 20 μL。

1.2.3 标准工作曲线的绘制 精密量取混合对照品溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分别置 10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得系列混合对照品溶液。分别精密量取系列混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。分别以混合对照品溶液的质量浓度（C，mg/L）为横坐标，测得峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 供试品溶液的制备 取藜麦样品适量，研细，过0.25 mm筛，取约1.0 g，精密称定，置100 mL具塞三角瓶中，加80%甲醇溶液50 mL，摇匀，称定质量，超声提取1 h，再回流提取1 h，取出，放至室温，用80%甲醇溶液补足质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，置100 mL具塞三角瓶中，加浓盐酸5 mL，回流水解1 h，水解液转移置100 mL量瓶中，加80%甲醇溶液稀释至刻度，微孔滤膜（0.45μm）过滤，即得供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择 尝试使用甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-醋酸溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-醋酸溶液等洗脱系统，结果发现，甲醇-水和乙腈-水洗脱系统所得色谱峰存在拖尾现象，比较磷酸、冰醋酸等扫尾剂，结果发现，磷酸改善峰形的效果更好，甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液对色谱峰的分离无明显差异，因此，使用经济性较好的甲醇-磷酸溶液洗脱系统，通过调整流动相的比例，选用甲醇-体积分数0.5%磷酸（体积比55∶45）时，样品中待测组分分离效果较好，槲皮素、山柰酚二组分能完全分离。色谱图如图1所示。

2.1.2 紫外检测波长的选择 槲皮素在254，360 nm处、山柰酚在265，360 nm处有最大吸收，比较254，265，360 nm波长处对藜麦样品含量测定时的影响，槲皮素、山柰酚均在360 nm波长灵敏度较高，并且没有杂质干扰。因此，确定360 nm作为检测波长[14]。

2.1.3 提取方法和溶剂对色谱含量测定的影响比较超声提取法、索氏提取法和回流提取法结果发现，索氏提取法与回流提取法测得的含量接近，超声提取法提取完全，待测组分含量最高。考察色谱甲醇、体积分数60%，70%，80%的甲醇溶液、无水乙醇、体积分数50%，70%，90%的乙醇溶液作提取溶剂，结果发现，体积分数80%甲醇溶液的提取效率最高。因此，选择体积分数为80%的甲醇溶液作为提取液。

2.2 标准曲线和线性范围

槲皮素标准曲线的回归方程为A＝66 688C－21 325（r＝0.999）；山柰酚标准曲线的回归方程为A＝80 912C＋5 517.4（r＝0.999）。结果表明，槲皮素、山柰酚的质量浓度分别在1.0～20.0 mg/L，0.5～10.0 mg/L范围内与所测得的相应的峰面积呈现良好的线性关系。

2.3 精密度

取槲皮素和山柰酚的质量浓度分别为4.0，2.0 mg/L的混合对照品溶液，按1.2.2色谱条件连续进样6次，记录色谱图。槲皮素和山柰酚峰面积的RSD分别为0.4%和1.3%，说明仪器的精密度良好。

2.4 重复性

取藜麦籽实粉约1 g，精密称定，按1.2.4步骤平行制备供试品溶液6份，按1.2.2色谱条件进样分析，记录槲皮素和山柰酚色谱图。计算槲皮素和山柰酚的平均含量分别为506.8，91.8 μg/g，相对标准偏差（RSD）所示分别为1.6%和1.6%。说明该方法的重复性良好。

2.5 稳定性考察

取室温放置的供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12，24 h，按1.2.2色谱条件进样分析，记录色谱图。计算槲皮素和山柰酚峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.5%和1.8%。表明室温放置的供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 回收率

称取含量已知的藜麦籽实粉约0.5 g（槲皮素、山柰酚含量分别为 506.8，91.8 μg/g），精密称定，共9份，按含量低、中、高分别加入不同体积的槲皮素和山柰酚对照品溶液，使其分别相当于藜麦籽实原有含量的75%，100%，125%，每一质量浓度重复3份，按1.2.4步骤制备供试品溶液，在1.2.2色谱条件下进行分析，记录色谱图，计算回收率，结果如表1所示。槲皮素的回收率平均为91.0%，RSD为0.4%（n＝9）；山柰酚的回收率平均为89.3%，RSD为1.6%（n＝9）。表明上述方法的回收率符合要求，准确度良好。

表1 槲皮素和山柰酚的加样回收结果

2.7 样品含量测定

分别取9个产地和不同加工工艺处理后的藜麦粉各1 g，精密称定，按1.2.2色谱条件和方法测定藜麦样品，计算槲皮素和山柰酚的含量（表2）。

表2 不同地区藜麦中槲皮素和山柰酚含量测定结果

续表2

3 结论

本试验建立了同时测定藜麦中的槲皮素和山柰酚2种黄酮类物质的高效液相色谱方法，样品用80%甲醇溶液超声波及回流提取后再加浓盐酸水解，水解液采用高效液相色谱法测定，可在20 min内完成槲皮素和山柰酚的含量测定。通过对样品提取方法和溶剂的优化，并选择甲醇-0.4%磷酸（体积比55∶45）为流动相，明显改善了峰形，以槲皮素和山柰酚均有较高灵敏度且无杂质干扰的360 nm作为检测波长，方法的线性范围、精密度、回收率、稳定性等均在液相色谱法允许的范围内，可在较宽浓度范围内对藜麦中的槲皮素和山柰酚进行同时分析，有助于提高藜麦检测的分析效率，降低检测成本，为藜麦的品质评价提供了一种简便可行、重复性好的质量控制方法。

4 讨论

如果样品不经水解，测得各产地藜麦籽实中槲皮素和山柰酚的含量普遍较低，这与文献中报道[15]的槲皮素和山柰酚在藜麦中多以苷的形式存在的结果相一致，所以，需要用盐酸水解的方法水解得到槲皮素和山柰酚。考察25 mL供试品提取溶液中加入不同体积的浓盐酸5，10，15 mL，结果加入浓盐酸5 mL时提取液中的槲皮素和山萘酚即可完全水解，因此，采用25 mL供试品提取液中加入5 mL浓盐酸水解。

试验结果表明，国内藜麦中槲皮素含量明显高于山柰酚，进口原产地藜麦中槲皮素和山萘酚的含量相当，甚至山萘酚含量会高于槲皮素。不同产地藜麦籽实中2种黄酮苷元含量存在明显差异，其中，青海省海西州都兰县香加乡种植的青藜一号中槲皮素含量最高，原产地玻利维亚的藜麦中山柰酚含量最高，这可能与藜麦品种及其产地的海拔、气候、土壤条件等有关[16]。

由于藜麦籽实的外壳中含有大量的皂苷类物质[17-19]，味苦涩且为有抗营养的作用，因此，使用前需先除去藜麦外壳[20]，常采用的方法有水洗、研磨和混合法。水洗法由于产生大量的污水而不适合现代工业加工生产；研磨法由于加工过程中为彻底除去藜麦外壳长时间研磨产生高温而破坏了藜麦中的活性成分，同样不适合藜麦的生产加工。采用短时研磨加水洗的混合法，通过短时研磨除去大部分藜麦外壳，再用一定温度的水洗涤藜麦籽实，彻底除去残余的藜麦外壳，这种混合处理的方式既不会产生高温也不会产生大量的污水，是一种理想的藜麦加工方法。本研究通过测定水洗法和混合法加工后藜麦中槲皮素和山萘酚的含量发现，混合法加工过后的藜麦中槲皮素含量稍有降低，降低了约7%，山萘酚含量不但没有降低反而比水洗法高，提高了约28%，这可能与藜麦加工时产生的热量促进了山萘酚的生成有关。

测定了藜麦籽实、叶、茎秆和种皮中槲皮素和山萘酚的含量，其中，藜麦叶片中槲皮素和山萘酚的含量最高，茎秆中2种物质的含量最低。说明藜麦叶片作为植物的营养器官[21]，黄酮类物质含量较高，而茎秆是植物的结构支撑器官，其所含的黄酮类物质很少。研究结果为今后藜麦植物的综合开发利用奠定了基础。

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