蒙礼娟，郑博文，乔建雄，张选奋

（1.兰州大学第二医院 整形美容外科，甘肃 兰州 730030；2.昆明市儿童医院 烧（创）伤整形外科，云南 昆明 650000）

皮肤老化的特征之一是透明质酸（hyaluronic acid，HA）逐渐减少。HA具有保水和填充作用，多点注射进入真皮层（即“水光注射”）已广泛用于皮肤美容治疗。然而，这种注射需要特殊设备和医务人员操作，存在诸多不便。如何提高外用HA的渗透能力，以方便求美者或患者居家自助使用，是研究的热点之一，对经皮渗透给药具有参考意义。经皮渗透给药的困难在于皮肤屏障严重限制大分子物质进入。微针[1]、电穿孔[2]、激光烧蚀[3]和化学促渗剂[4]等方法短期轻微破坏或改变皮肤屏障已被用于促进物质经皮渗透。其中，微针穿刺最简便易行，且本身具有紧肤等美容作用。

微针针刺皮肤创建的微米级孔道，可使亲水性和大分子物质如siRNA[5]、疫苗[6,7]和胰岛素[8,9]等穿过，从而发挥治疗作用。在一定范围内，微针直径和密度越大，物质的透皮量越多。但是，微针直径＞16G（约1650μm），则在人类皮肤遗留瘢痕，而微针密度＞2000/cm2时，“钉床效应”使透皮量下降[10-13]。总之，皮肤上微孔的保持时间和愈合情况决定主药的经皮渗透量和临床应用。然而，渗透量最适的微针直径和HA分子量等尚不清楚，我们作了研究。报告如下。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

TP-3A型ZTY智能透皮实验仪（巩义市宏华仪器设备工贸有限公司）；25G、22G、18G针头（上海康德莱企业发展集团股份有限公司）；酶标仪3001（Thermo SCIENTIFIC）；0.22μm微孔滤膜（上海密粒膜分离技术有限公司）。

1.2 材 料

试剂：10kDa、100kDa、1000kDa、1500kDa的HA（化妆 品 级， 批 号：1603221、1511103、1503103、1506112， 含 量 95.7%、95.9%、95.9%、96.0%，华熙福瑞达生物医药有限公司）；Rat HA ELISA KIT（上海酶联生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 试剂配制

1%HA溶液：精密称取HA 0.050g，加PBS液5ml，静置2h，玻璃棒充分搅拌溶解，制成1%HA溶液，现用现配。

2.2 微针阵列模型的制备

将25G、22G和18G针头，均匀刺入直径为15mm的圆形橡胶片，密度为30针，尖端露出长度700μm。用胶水将10ml注射器针筒与此橡胶片黏连固定，针筒内灌入蜡汁，冷却凝固，制成微针阵列模型（图1）。

2.3 体外透皮实验

2.3.1 离体皮肤和微针穿刺皮肤制备

离体皮肤制备：SD大鼠，10%水合氯醛（0.003ml/g）腹腔注射麻醉，剃眉刀剃去背部毛发，饲养48h拉颈处死，切取皮肤，修去皮下组织，生理盐水反复冲洗，即为离体完整皮肤。生理盐水纱布包裹，4℃冰箱保存，24h内使用。

图1 微针阵列模型 Fig1. Microneedle array model

微针穿刺皮肤制备：将离体完整皮肤裁成2.0cm×2.0cm大小，平铺于泡沫板上，角质层朝上，用不同型号微针阵列穿刺皮肤，即为微针穿刺皮肤。

2.3.2 正交实验设计

以针头型号G、HA分子量Mr和透皮时间T作为考察因素，每个因素4个水平，即G（无针头、25G、22G、18G）、Mr（10kDa、100kDa、1000kDa、1500kDa）、T（1h、3h、5h、7h）， 依据正交表L16(45)，获得16组实验组合。

2.3.3 体外经皮渗透实验

采用改良Franz扩散池，有效渗透面积约1.767cm2，接受室容积18.5ml。将离体完整皮肤和微针穿刺皮肤固定在供应室与接受室之间，角质层面向供应室。接受室加PBS 18.5ml，供应室加1%HA溶液0.5ml，保鲜膜封闭供应室；双重水浴循环，371℃恒温，磁力搅拌器恒速30050 r/min搅拌。按正交实验组合进行实验，到指定时间点从接受室吸取接收液1.0ml。为了排除皮肤组织本身存在HA的影响，设空白对照组（空1h、空3h、空5h、空7h），空白组的供应室加PBS 0.5ml。接收液用0.22μm滤膜过滤，用Rat HA ELISA KIT测定HA浓度。渗透量Q = CT－C空T，其中CT为每个正交实验组合的接收液浓度，透皮时间为T；C空T为空白对照组透皮T小时的接收液浓度。

2.4 体内实验

2.4.1 大鼠备皮和标记

SD大鼠麻醉后，剃眉刀剃去背部毛发，用蘸有亚甲蓝溶液的10ml注射器针筒印于背部剃毛区的脊柱两侧，每侧3个，对称分布（图2a），饲养24h备用。

2.4.2 溶液外用方法

10ml注射器针筒边缘用医用胶布缠绕，制成容器，用胶水将容器沿标记轮廓与皮肤粘住即可（图2b），在针筒内加入适量PBS液，观察4h未见液体外渗（图2c）。取皮时沿着针筒内圈剪下皮肤组织。

图2 a 大鼠标记方法，b 容器固定方法，c PBS观察漏液情况Fig.2 a、 Labeling method, b 、Container fixing method, c、Observation of leakage by using PBS

2.4.3 微针针刺后皮肤反应观察

SD大鼠麻醉后，75%酒精消毒2遍，脊柱两侧分别用22G、18G微针针刺，无菌生理盐水湿纱布包扎，自然愈合0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、36h，2名无关专业人员分别观察皮肤红斑和水肿等反应，选出最佳微针。

无红斑（针眼周围颜色同正常皮肤）记0分；轻微红斑（针眼周围可见线状红晕环）记1分；明显红斑（红晕环小于1/3针距，覆盖面积小于50%）记2分；重度红斑（红晕环小于1/3针距，但覆盖面积大于50%；或针距间被红晕环完全填充）记3分。

无水肿（平周围正常皮肤）记0分；轻度水肿（水肿高度小于1/3针距，覆盖面积小于50%）记1分；中度水肿（高度小于1/3针距，覆盖面积大于50%）记2分；重度水肿（高度大于1/3针距）记3分。

最佳微针针刺后组织学观察和HA经皮渗透的时间点设计见图3。微针针刺后，无菌纱布覆盖，到每个时间点后，取开纱布，分别进行下列操作。

组织学观察：取全层皮肤行HE染色，光学显微镜下观察，拍照记录。

图3 体内实验时间点设计Fig.3 Design of time point in vivo experiment正常对照：无微针预处理正常皮肤外用HA；空白对照：无微针预处理正常皮肤外用PBS。

HA体内透皮实验：按2.4.2中所述方法外用PBS液或HA溶液，渗透4h后，用PBS湿棉签擦去皮面残留的HA，切取全层皮肤，PBS液洗净后，将皮肤和肉膜分开，各自称重，按体重（g）：液体（ml）=1:4的比例加PBS液，350 r/min匀浆6min，吸取匀浆液，4℃、13000 r/min离心10min，分成脂肪层、透明液体层、组织层3层，吸取中间的透明液体层，上述条件反复离心4次，吸取待测液用0.22μm滤膜过滤，用Rat HA ELISA KIT测定样本HA浓度。

2.5 统计学处理

正交设计软件V3.1进行正交实验分析。皮肤和肉膜中HA含量用（x±s）表示。统计学软件SPSS19.0进行统计学分析。样本均数之间的比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有显著性。

3 结 果

3.1 体外透皮实验结果

针头越粗、HA分子量越小、渗透时间越长，HA的透过量增加（P＜0.05，表1、表2、图4）。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

透过量较大的组合为“18G-10k-7h”、“18G-100k-5h”、“22G-10k-5h”、“22G-100k-7h”，考虑Mr越大，其降解速度越慢，效果越持久，Mr定为100kDa，当T在3h～5h段，其透皮速率最大，所以将T定为4h，而G在22G或18G中根据针刺后皮肤的反应情况选择。

图4 G、Mr、T的变化趋势Figure.4 Changing trend of G、Mr and T随着针头的增粗，透过量增加，斜率变小；随着分子量的增大，透过量减少，斜率变小；随着透皮时间的增加，透过量增加，在3～5h之间，斜率最大。

表1 G-Mr-T正交实验结果Tab.1 G-Mr-T Orthogonal experimental results

3.2 微针针刺后皮肤反应结果

各时间点评分结果均为0分，无红斑及水肿。随着时间延长，微孔变小，22G针刺部位在15h愈合，而18G针刺部位到21h愈合，两者到24h恢复正常皮肤形态（图5）。为方便使用，HA的透皮时间在4h内最佳，因此，最佳针头选用22G，最优体内实验组合为“22G-100kD-4h”。

图5 皮肤反应及微孔愈合情况 Fig.5 Skin reaction and microporous healing22G微针针刺后15h基本愈合，而18G延迟到21h，两者到24h恢复正常皮肤形态

3.3 组织学观察结果

22G微针针刺后皮肤屏障破坏，深达真皮乳头层，随着愈合时间的延长，微孔变小。到18h，微孔被增生的表皮细胞覆盖，皮肤屏障结构基本恢复（图6）。

图6 皮肤愈合组织学观察（HE×10） Fig.6 Histological observation of skin healing(HE×10)随时间延长，微孔收缩变小。到18h，微孔被表皮细胞覆盖，皮肤屏障结构基本恢复（箭头指向微孔创面）。

3.5 HA在体透皮实验结果

22G微针针刺后经过0h、3h、6h、9h、12h、15h，再涂抹HA并渗透4h，皮肤内HA含量分别高于正常对照组1.29、1.24、1.14、1.05、1.03、1.01倍且随着愈合时间延长，HA量减少（P＜0.05，图7），而针刺后愈合18h、21h、24h后，再涂抹HA并渗透4h，皮肤内HA含量与对照组相同（P＞0.05，图7）。正常对照组皮肤HA含量与空白对照组相同（P＞0.05，图7）。

针 刺 后 经 过 0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h后，涂抹HA、渗透4h，肉膜层HA含量没有变化（P＞0.05，图7）。

图7 各时间点HA含量（n=5，a 皮肤 b 肉膜）Fig.7 HA content at each time point (n=5, a skin, b dartos)与正常对照组比较，*P＜0.05。0h组、3h组、6h组、9h组、12h组、15h组两两之间比较， P＜0.05。

4 讨 论

透皮给药是一种新型的给药方式，因皮肤屏障，Mr＜500Da的物质能够透皮吸收[14]，促渗剂或非有创促渗透方法可使500 Da＜Mr＜1000 Da的物质渗入皮肤[15]，而微针穿刺的微孔道则可以快速透过Mr＞10 kDa的大分子物质如胰岛素[8,9,16]、疫苗[6,7]和DNA[5,17]等，因此，微针是目前经皮给药技术的研究热点之一。

微针促渗作用的影响因素很多。①、针头外径与透过量成正比。针头越粗，形成的通道也粗，渗透速率就快。②、透皮量与渗透物质的Mr成反比[18]。我们发现，随着HA分子量增加，微针的促渗效果越差。③、储库中药物的物理性状有显著影响：储库中的HA呈水溶液如Mr≤1000kDa时，渗透量大，而1500kDa的HA呈凝胶状，渗透量就小。④、皮肤的活性和透皮时间也影响药物经皮渗透量。在无修复能力的离体皮肤，药物迅速透过达到峰值后在稳态维持[19]，但体内皮肤的创伤修复过程导致药物以最大流速快速达到峰值，此后逐渐下降而无稳态阶段[19]。创伤修复过程包括皮肤组织弹性回缩、伤口收缩和增殖等，使微孔逐渐变小直至闭合，角质层修复，皮肤屏障得以恢复。因此，皮肤创伤愈合过程严重影响微针促进HA的透皮能力。我们的研究结果与此一致。⑤、微针的刺入深度不是影响透皮速率的决定因素[13,19,20]，但影响治疗的舒适感。微针长度多在600μm～800μm之间[21,23]，使用时仅刺入120μm～160μm，到真皮乳头层，在皮肤屏障形成微小通道，但不损伤真皮乳头层中的神经和毛细血管，避免产生痛感和不适感，减轻炎症反应[24]。

微针所致皮肤伤口愈合，皮肤屏障功能恢复，恢复的时间与微针的外径密切相关。正常肤屏障仅允许经皮水分流失（Transepidermal water loss,TEWL）约2～5 g·cm-2·h-1，以保持皮肤湿润、光滑、柔韧和弹性[25]。皮肤的完整性及屏障功能破坏时，TEWL值将升高。微针所致伤口愈合过程中，微孔逐渐缩小，TEWL降低，至伤口完全愈合时，TEWL恢复正常的基线水平[16,17,21-23,26-28]，但愈合时间主要由微针外经决定。我们肉眼观察发现22G微针穿刺皮肤后，伤口15h基本愈合，而18G微针到21h才基本愈合。组织学观察发现，22G微针针刺后3h，微孔的伤口内形成纤维蛋白栓子。随着愈合时间延长，纤维蛋白栓子增多，从微孔底部向上填充，伴随微孔缩小，表皮细胞增殖，逐渐覆盖伤口，到18h，伤口完全被覆盖，皮肤屏障实现结构性恢复。

这一愈合过程决定HA透过量的变化。22G微针针刺后立即给予100kDa的HA外用4h，其透皮量大幅度增加；而经过一定的愈合时间后再给予HA，其透过量逐渐下降，到18h后，未见明显HA透过，而肉膜层HA含量未见变化，显然与微针的结构和HA的特性有关。微针仅穿刺到真皮浅层，HA经皮肤微孔道渗透到达真皮层后，即发生水合作用，体积增加，起到填充和润泽皮肤的作用。

综合上述，22G微针针刺后外用100kDa的HA渗透4h（3h～5h）的皮肤透过量最大，但HA无法渗透进入肉膜层，且皮肤创伤反应轻微，伤后18h内愈合。提示22G微针针刺后外用100kDa的HA渗透4h（3h～5h）可以替代“水光注射法”给皮肤补充HA。

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