谢 冲，管阳太

上海交通大学医学院附属仁济医院神经内科，上海 200127

最新的疾病负担研究显示，在中国，导致早死所致生命损失年（years of life lost，YLL）最高的疾病是脑卒中[1]。最新流行病学数据显示，中国脑卒中的年龄标化患病率、发病率和死亡率分别为1 114.8/10万、246.8/10万人年和114.8/10万人年；中国农村居民脑卒中发病率（298.2/10万人年）显著高于城市居民（203.6/10万人年）[2]。脑卒中严重影响人民的健康，同时也给社会带来巨大的经济负担。国家卫生健康委员会脑卒中防治工程委员会发布的数据显示，中国脑卒中患者约700万人，每年因脑卒中带来的经济负担达400亿元[3]。因此，如何有效地治疗脑卒中以及促进脑卒中患者的功能恢复是目前亟待解决的重大难题。

脑卒中后及时的康复训练可以促进大脑的重塑和神经功能的恢复[4]，但是恢复的效果随着时间的迁延而减退，并且神经功能恢复在数月后进入“高原期”。由此说明，神经的内源性修复存在时间局限性[5]。在组织学水平上，通过促进神经和血管的再生可以提高神经功能恢复的水平。然而，迄今为止，所有通过促进内源性神经修复来改善脑卒中患者临床症状的药物尝试都是失败的[6]。基于上述研究结果，促使研究者关注于探索促进神经修复的外源性方法。

随着干细胞研究的不断深入，以神经干细胞（neural stem cell，NSC）为基础的细胞治疗在脑卒中和神经退行性疾病的治疗中显示出巨大的应用潜力。多项研究表明，NSC可以延长脑卒中药物干预的时间窗，减少梗死面积，改善神经缺损症状，促进神经修复[7-8]。当前有关NSC治疗脑卒中的临床前研究日益增多[9]。2016年8月，Lancet报道了首个人源性NSC治疗缺血性脑卒中Ⅰ期临床试验的结果，目前Ⅱ期临床试验正在进行之中[10]。本文旨在总结近年来NSC从实验室进入临床试验的进程，并探讨NSC治疗机制及临床应用前景，以期为更多高质量临床试验的开展提供文献支持。

1 NSC治疗脑卒中的机制

为提高和优化NSC的治疗价值，从细胞学、分子学和生物学角度理解NSC发挥治疗效果的机制至关重要。目前认为，NSC主要通过以下三个方面的机制发挥治疗作用：一是直接替代梗死组织中的神经元，修复神经通路；二是通过旁分泌、免疫调控等手段发挥神经保护作用；三是促进内源性神经和血管再生。

1.1 直接的细胞替代

内源性NSC主要存在于血管微环境中，其中大部分保持未分化状态，通过直接接触或释放可溶性因子与周围环境相互作用。在梗死病灶中，内源性NSC很少通过直接参与分化为神经元或胶质细胞以实现组织修复。注射入体内的外源性NSC则可以在体内进行迁移并分化为神经细胞。注射入体内的NSC可以分化为多种类型的细胞，包括神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞，且部分细胞表达血管特异性标志物[11-12]。然而，单纯的细胞替代学说正在受到质疑，这是因为其治疗效果往往并不与外源性细胞的存活或分化比例相关[13-14]。总之，虽然移植的NSC在体内表现出一定的存活和分化能力，但尚未对此达成共识，因此仅用细胞替代学说以解释NSC的治疗作用尚不全面。

1.2 改善宿主局部微环境

在NSC移植后，宿主脑组织内的细胞增殖会显著增强[12,15]。移植的NSC增强内源性神经再生的原因可能与释放某些神经营养因子或抑制局部炎症和细胞凋亡有关。人源性NSC可以分泌多种营养因子，从而直接促进内源性神经再生[15-18]。

研究表明，脑卒中后3个月时，脑组织内仍然存在炎症，抑制脑室下区（subventricular zone，SVZ）的细胞增殖，而外源性NSC可以逆转这一过程[12]。注射NSC后，可以观察到NSC通过借助各种黏附因子和炎性细胞因子而最终到达中枢神经系统（central nervous system，CNS）病灶周围，而CNS病灶周围的CD45＋淋巴细胞数量明显减少，CNS内浸润的CD4＋T细胞所占比例及绝对数量均明显下降[19-20]。

1.3 促进血管再生

血管再生是组织再生的一个必备和先决条件，而移植的NSC同样可以增加病灶的血供。人源性NSC在体外可以释放血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），而VEGF可以通过促进新生血管生成以增加局部组织的血供[21-22]。体内研究发现，NSC可以增加缺血大鼠模型的血供，在移植NSC后12～14 d，缺血组织的血供可以恢复至基线水平[23]。NSC还可以通过分泌表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）以影响血管内皮细胞的生成。还有研究发现，NSC可以通过直接接触方式以促进血管内皮的生成[7,13]。NSC与血管内皮细胞在空间上逐渐靠近，促使血管内皮细胞形成新生血管，而血管内皮细胞反过来又可通过释放可溶性因子以促进NSC分化。血管再生与神经再生在时间和空间上存在严密调控和相互协调的关系。

2 人源性NSC制备技术的发展

人源性NSC是一种较好的脑卒中治疗选择，这是因为NSC可以在体外通过特定培养基和营养因子（如EGF、FGF等）进行规模性增殖，并且由于NSC具有自我增殖的特性，因此可以不断地传代下去，从而避免了细胞来源不足的难题。早期的人源性NSC大多来源于捐献的胚胎，而随着诱导多能干（induced pluripotent stem，iPS）细胞技术的发展，目前已经实现了从体细胞到诱导NSC的转化，从而解决了取材困难和免疫排斥的难题。然而，在应用人源性NSC时同样面临一些问题，如NSC培养所形成的细胞球内混杂着不同增殖阶段的干细胞或前体细胞，细胞的同质性较差，从而影响干细胞实验结果的效力[24]。此外，实验发现，人源性NSC会随着不断地传代，表现出增殖活性降低、基因突变增多等现象，而传代细胞在细胞活力和分化潜力上亦不尽相同[25-26]。为解决上述问题，转录因子Myc被用于人源性NSC的改造。实验发现，Myc可以延长NSC的传代周期，保持NSC基因型的稳定，进而形成“永生细胞系”[27]。

ReNeuron公司生产的CTX细胞是一种成熟的人源性NSC产品，被当前绝大多数临床前实验和临床研究所应用。CTX细胞的主要作用是将c-Myc基因连同控制元件插入NSC基因中，在维持细胞多能性和增殖活性的同时，通过控制元件以确保细胞处于相同的增殖阶段，并批量保存于“细胞银行”中。一旦细胞被输注入体内，c-Myc与控制元件发生甲基化而失去作用，可防止干细胞的永久增殖。随着技术的进步，CTX细胞已逐步实现自动化生产和储存，出厂后可以直接进行临床注射使用，而无需进行再次复苏与检测，真正实现了商业化随取随用。

3 NSC治疗缺血性脑卒中的临床前研究

在开展临床试验之前，研究者通过开展大量的临床前研究以评估NSC治疗缺血性脑卒中的安全性和有效性。最常采用的缺血性脑卒中动物模型为大鼠线栓法大脑中动脉阻断（middle cerebral artery occlusion，MCAo）模型。线栓法的基本原理是通过线栓阻闭大脑中动脉起始部，造成大脑中动脉供血区缺血，从而使大鼠发生局灶性脑缺血，引发局部脑组织缺血性坏死，继而表现出各种神经功能缺损症状。此方法的优势是稳定性好、重复性好、损伤小、梗死部位确切且成功率高。通过开展MCAo模型实验，研究者已积累了大量有关NSC治疗缺血性脑卒中的数据（表1），为NSC治疗脑卒中临床研究的开展奠定了基础。

多项使用CTX细胞的动物实验表明，人源性NSC在大鼠体内可以分化为神经元和神经胶质细胞，可有效改善MCAo模型大鼠的运动与感觉功能，但是对于高级认知功能（如记忆和学习）则无明显的改善作用[11-12]。大鼠神经功能的改善与脑内注射的外源性NSC数量成正比，而不与最终存活的外源性NSC数量成正比，由此说明外源性NSC的治疗作用并不直接依赖于存活细胞所发挥的神经细胞替代作用，而可能与注射的外源性NSC的旁分泌作用（神经营养因子的释放）有关，旁分泌机制可导致内源性神经再生能力的加强[12]。除了CTX细胞，其他人源性NSC系也被应用于缺血性脑卒中的动物实验。研究者同样发现人源性NSC可以改善大鼠的神经功能、减少梗死面积，且外源性NSC还具有免疫调节特性，可以通过调控白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10等炎性细胞因子的分泌以抑制脑组织的局部炎症，促进内源性神经再生和血管生成[28-29]。除了人源性NSC以外，鼠源性NSC也被应用于MCAo模型的治疗。CHEN等[30]发现，外源性NSC改善神经功能的作用可能与调控内源性NSC的分化有关，即增强神经元的生成而抑制NSC向胶质细胞分化。

表1 NSC治疗缺血性脑卒中临床前研究

4 NSC治疗缺血性脑卒中的临床研究

目前已完成或正在进行中的2项人源性NSC治疗缺血性脑卒中的临床试验均采用CTX细胞。PISCES Ⅰ期临床试验[10]已完成，数据已发表，PISCES Ⅱ期临床试验目前已完成患者招募工作。

第1项人源性NSC治疗缺血性脑卒中的临床试验是在英国完成的，这项PISCES Ⅰ期临床试验的结果显示，NSC可以改善患者的神经症状评分，且未发现严重不良反应[10]。PISCES Ⅰ期临床试验是一项开放的单臂研究，入组患者为11例年龄为60岁以上的处于稳定期的缺血性脑卒中男性患者，接受1×106、5×106、10×106或20×106个CTX细胞的脑内注射；主要终点事件是脑内注射CTX细胞的安全性和耐受性，次要终点事件是治疗后24个月时的神经功能评分[10]。在整个研究期间，未发现CTX细胞相关不良事件；4例患者出现与脑内注射相关的无症状性不良反应，未引发癫痫[10]。研究结果显示，脑内注射CTX细胞后，随着时间的推移，患者的美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）评分有所改善，但是Barthel指数和上下肢Ashworth分级评分均无明显改善；脑内注射CTX细胞后第12个月，4例患者的改良Rankin评分表现为1个级别的改善，其余7例患者的改良Rankin评分无明显变化；脑内注射CTX细胞后第24个月，7例患者的改良Rankin评分无明显变化，1例患者的改良Rankin评分表现为2个级别的恶化，3例患者的改良Rankin评分表现为1个级别的改善[10]。

由于PISCES Ⅰ期临床试验[10]入组患者少，且未设对照组，因此该研究结论的可靠性尚待验证。在完成PISCES Ⅰ期临床试验后，PISCES Ⅱ期临床试验也已正式启动，纳入大脑中动脉区缺血性脑卒中后遗留上肢瘫痪的40岁以上男性或女性患者，至少21例；试验设计为多中心、单臂、开放研究；每一例入组患者在脑卒中后3个月时，接受脑内注射20×106个CTX细胞（即PISCESⅠ期临床试验中采用的最高细胞数）；观察周期为12个月，主要终点事件为上肢功能恢复情况以及包括NIHSS评分、Barthel指数、改良Rankin评分在内的神经功能和残疾度指标。

5 小结与展望

本文从治疗机制、制备技术、临床前研究和临床研究等方面详细回顾了人源性NSC从实验室走入临床应用的进程。目前的临床前研究和Ⅰ期临床试验均显示出NSC治疗缺血性脑卒中的光明前景。然而，目前已开展的临床试验尚存在不少局限，如样本量小、观察期短，以至于无法发现相对少见的不良反应（包括成瘤性）。外源性NSC在注射入人体后，必须严密监测其增殖特性，以防肿瘤生成。此外，值得关注的是，目前开展的临床研究均未详细规范入组患者的生活方式和康复锻炼方法，而这些对于慢性缺血性脑卒中患者而言十分重要，长期的生活方式和康复锻炼方式的差异可能会干扰研究结果，因此后续研究应将此纳入考量。

总之，今后有待开展更多设计合理的NSC治疗缺血性脑卒中的临床研究，以推动NSC在缺血性脑卒中患者中的合理应用。