豆姗姗，艾阳，陆思静

既往20年内，鲍曼不动杆菌（AB）已逐渐成为一种主要的，且具有高致病率和高病死率的院内致病菌［1］。菌株耐药性迅速形成与播散，使多重耐药（MDR）甚至泛耐药（XDR）AB的临床检出率均明显上升，成为全球医疗安全的威胁。有报道显示，临床分离的AB对碳青霉烯类抗生素的耐药率高达80%，对头孢哌酮/舒巴坦（CFS）、左氧氟沙星（LVX）、米诺环素的耐药率约为40%［2-3］。MDR-AB对最后一线治疗药物替加环素（TIG）和多粘菌素逐渐表现出耐药，但很少有新的抗生素问世，因此，迫切需要选择有效的治疗方案来控制MDR-AB的感染率和耐药率。目前以TIG、β-内酰胺酶抑制剂和多粘菌素为基础的药物联合治疗MDRAB感染的研究已取得了一些成绩［4］，而具体治疗方案及用药剂量尚未确定，仍需进一步探究。本实验目的在于评价舒巴坦（SUL）、CFS、TIG分别结合多粘菌素B（PMB）、美罗培南（MER）、比阿培南（BPM）、亚胺培南（IPM）和LVX对临床分离MDR-AB的体外抗菌活性，并探讨药物联合对MDR-AB效应，为临床选择及应用抗菌素提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 选取2016年7月—2017年3月在锦州医科大学附属第一医院ICU、烧伤科、呼吸内科、神经内科、血液科收集的70株非重复MDR-AB菌株，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853（由广州市南方医院临床微生物室提供）。

1.1.2 药品与试剂 SUL、CFS、MER、BPM、IPM、TIG、PMB和LVX（均购自中国药品生物制品监督管理所）。MH肉汤（上海万疆生物技术有限公司）；血平板（广东环凯生物科技有限公司）。

1.1.3 仪器 BD-100全自动微生物分析仪；DHP恒温培养箱（上海实验仪器厂）；比浊仪（法国梅里埃公司）；微量加样器；96孔板（美国康宁公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌药物溶液与菌悬液的配制 抗菌药物溶液参照CLSI2012版［5］配制，其中LVX用前现配。在已分纯并过夜新鲜培养的细菌平板上挑取4～5个形态相同的菌落接种于MH肉汤中增菌6 h，然后于3 ml无菌0.9%氯化钠溶液中用比浊仪调整浓度至0.5麦氏单位，再用MH肉汤按1∶1 000稀释，即为接种菌悬液。

1.2.2 微量肉汤稀释法与棋盘法 SUL、CFS、MER、BPM、IPM、TIG、PMB贮备液和LVX以灭菌的MH肉汤倍比稀释成1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/ml等系列浓度，将上述药物按相应的浓度梯度加入96孔板中，每孔50 μl，接种菌悬液100 μl，37 ℃培养20 h，读取结果并记录单独用药时的最低抑菌浓度（MIC）。将配制好的1/32 MIC～4 MIC（μg/ml）的抗生素按棋盘法［6］两两组合加入96孔板中，每种药物 50 μl，接种菌悬液 100 μl，37 ℃培养20 h。读取结果，记录最佳组合效应时两药各自的MIC值。

1.2.3 联合用药效果判定［5］部分抑菌浓度（FIC）指数是判定两药联合作用的主要指标，FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用。FIC指数≤0.5为协同作用，0.5＜FIC＜1.0为部分协同作用，FIC＝1.0为相加作用，1.0＜FIC≤4.0为无关作用，FIC＞4.0为拮抗作用。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行录入与分析，多分类变量资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 8种药物单用与联用对MDR-AB的MIC值 各种抗菌药物单用时的MIC值显示，SUL、CFS、MER、BPM、IPM对MDR-AB均表现为耐药；TIG、PMB、LVX的敏感率分别为28.5%、31.4%、17.1%。药物联用后，SUL、CFS、MER的MIC50和MIC90降至单药时的1/4；BPM、IPM、PMB和TIG均降至单药时的1/2；TIG、PMB、LVX的敏感率有所上升（见表1）。

2.2 浓度-累积抑菌率 SUL、CFS分别与MER、BPM、IPM、TIG、PMB联用后，浓度-累积抑菌百分率曲线均显著左移，其中和MER联合后曲线左移幅度较大，SUL的 MIC50、MIC90由 64 μg/ml和 128 μg/ml分别降至 16 μg/ml和 32 μg/ml，CFS的 MIC50、MIC90由 128 μg/ml和 256 μg/ml分 别 降 至 32 μg/ml和 64 μg/ml；而TIG分别与SUL、CFS、MER、IPM、PMB、LVX、BPM联合后，曲线整体左移幅度不大，其中左移较明显的组合为TIG+MER（见图1～3）。

表1 药物单用与联用对MDR-AB的MIC值和敏感率Table 1 MICs and sensitivity rate of SUL，CFS and TIG used alone and in combination with other antibiotics against 70 strains of MDR-AB

图1 SUL单用及联合其他抗生素的浓度累积抑菌率曲线Figure 1 Cumulative concentration curve of SUL used alone and in combination with other 5 antibiotics against 70 strains of MDR-AB

图2 CFS单用及联合其他抗生素的浓度累积抑菌率曲线Figure 2 Cumulative concentration curve of CFS used alone and in combination with other 5 antibiotics against 70 strains of MDR-AB

图3 TIG单用及联合其他抗生素的浓度累积抑菌率曲线Figure 3 Cumulative concentration curve of TIG used alone and in combination with other antibiotics against 70 strains of MDR-AB

2.3 药物组合对70株MDR-AB菌株的FIC指数分布各药物联合后FIC指数多为≤1.0，表现为协同、部分协同和相加作用，无拮抗作用出现。SUL+TIG与CFS+TIG的疗效比较，差异无统计学意义（χ2=0.722，P＞0.05）。SUL+MER 和 CFS+MER、SUL+BPM 和CFS+BPM、SUL+IPM和 CFS+IPM、SUL+PMB和CFS+PMB的疗效比较，差异均无统计学意义（χ2=0.574、3.257、5.180、6.959，P＞0.05）。SUL分别联合TIG、MER、BPM、IPM、PMB的疗效比较，差异有统计学意义（χ2=101.501，P＜0.05，见表2）。TIG分别联合MER、BPM、IPM、SUL、PMB和LVX的疗效比较，差异有统计学意义（χ2=54.460，P＜0.05，见表3）。

表2 SUL、CFS与TIG、MER、BPM、IPM、PMB联合对MDR-AB菌株的FIC指数分布（n=70）Table 2 Distribution of FIC indices of SUL or CFS in combination with TIG，MER，BPM，IPM or PMB against MDR-AB

表3 TIG与SUL、BPM、IPM、LVX、MER、PMB联合对MDR-AB菌株的FIC指数分布（n=70）Table 3 Distribution of FIC indices of TIG in combination with SUL，BPM，IPM，LVX，MER or PMB against MDR-AB

2.4 TIG敏感与耐药菌株与各药物组合的FIC指数分布比较 单药药敏试验结果显示，70株MDR-AB菌株对TIG敏感20株，对TIG耐药50株。TIG敏感菌株与耐药菌株分别联合SUL、MER、PMB的FIC指数分布比较，差异均无统计学意义（χ2=0.910、6.210、3.350，P＞0.05）；TIG敏感菌株与耐药菌株联合LVX的FIC指数分布比较，差异有统计学意义（χ2=13.490，P＜0.05，见表 4）。

3 讨论

AB具有多重耐药机制，MDR-AB的感染率在全球范围内日益增加［7］，而对于MDR-AB的治疗已成为医学界的一大难题。由于单一用药的作用不佳，且易诱导细菌耐药，联合用药因药物间的协同作用而备受关注［8-9］。目前对于MDR-AB的治疗，主要以SUL或含SUL的复合制剂、TIG及多粘菌素为基础联合其他抗生素［10-12］，依据体内外实验及药效学和药动学选择合适的剂量来进行治疗。国内外已有大量文献对药物联合治疗MDR-AB进行了研究，如王风娟等［13］研究结果显示，TIG联合MER或阿米卡星对实验的MDR-AB具有较高的协同率；PONGPECH等［14］报道，多粘菌素分别联合IPM、MER对MDR-AB的体外抗菌活性优于单一用药；但针对MDR-AB关于其他药物同时分别联合MER、BPM、IPM的报道较为少见。

表4 对TIG敏感与耐药菌株分别联合SUL、MER、LVX和PMB的FIC指数分布情况〔n（%）〕Table 4 Distribution of FIC indices of TIG in combination with SUL，MER，LVX or PMB against TIG-sensitive and TIG-resistant strains

本实验结果显示，SUL、CFS分别联合TIG、MER、BPM、IPM、PMB对MDR-AB的抗菌作用无明显差别，表明CFS治疗MDR-AB时SUL起主要作用［15-16］；SUL、CFS与MER联合后表现出较高的协同率，分别为40.0%、45.7%，与文献报道［17-18］的MER与SUL 44.4%协同、与CFS 54.3%协同的结果相符，其机制可能与SUL抑制部分苯唑西林酶的活性，降低细菌对MER的耐药有关。MER联合TIG、SUL、CFS对MDR-AB的抗菌活性无明显差别，但优于BPM、IPM与之联合，这可能与MER、BPM、IPM的分子结构及对AB的耐药机制不同有关。其中MER的分子结构中含有1-β-甲基和吡咯烷-3-硫基，BPM与IPM分别只含有1-β-甲基和吡咯烷-3-硫基，而这些结构均与青霉素结合蛋白（PBP）的结合力有关；MER、IPM的耐药机制主要为PBP的改变、产碳青霉烯酶、膜孔蛋白缺失或表达降低、外排泵机制上调，其中以MER为底物的外排泵多于IPM，而BPM的耐药机制在现有报道中主要为产碳青霉烯酶，其他机制尚不十分清楚［14，19］。MER与其他抗生素联合后，可能因以MER为底物的外排泵表达下调，MER的抗菌活性增加，所以联合效应优于BPM、IPM。因此，在临床选择治疗MDR-AB的药物时，对于SUL和CFS，结合治疗效果及经济因素，且现今市场上也有SUL单一制剂，优先推荐SUL。在SUL联合其他抗生素时，依据本实验结果，SUL联合MER优于SUL联合PMB，且MER费用较低，因此临床首选推荐SUL联合MER。

TIG为米诺环素衍生的甘氨酰环类抗生素，抗菌谱广，一直被作为治疗AB感染的最后一线药物。在本实验中，50株（50/70，71.4%）MDR-AB对于TIG耐药，这与TIG在临床治疗AB的普遍应用有关，而大部分菌株的来源者在临床治疗过程中并未使用TIG治疗，这与其他抗生素诱导RND和AdeABC外排泵过度表达密切相关［20］。本实验结果发现，TIG与MER联合后表现出较高的协同率，为45.7%，结果与国外文献报道相符［21］。TIG与SUL、BPM、PMB联合后的协同率分别为25.7%、37.1%、34.3%，而与IPM、LVX联合效果则以不相关为主，协同率分别为8.6%、14.3%。这与文献报道的TIG与SUL、MER、PMB的协同率分别为5.3%、29.8%、14.3%有一定差异［13］，其原因是不同地区流行菌株耐药表型可能存在较大差异。TIG与MER表现出较高的协同率，其机制可能为TIG的9-疏丁基甘氨酰基可克服部分外排泵的外排［22］。在对TIG敏感与耐药的菌株中，TIG+LVX组在TIG耐药菌株中的抗菌效果明显优于TIG敏感菌株，这可能与LVX干扰细菌DNA的复制，进而影响一些蛋白的合成（可能包括外排泵蛋白），最终减轻MDR-AB对TIG的耐药有关。进而，在治疗MDR-AB时，TIG联合MER略优于TIG联合PMB，且国内市场上PMB较少，结合经济原因，首选推荐TIG联合MER。而在TIG耐药的菌株中，可以尝试应用TIG联合LVX进行治疗。

综上所述，CFS治疗MDR-AB时SUL起主要作用；TIG联合MER与SUL联合MER均对MDR-AB具有较好的体外抗菌活性，而两组合的协同率及部分协同率无统计学差异，且SUL较TIG费用低，因此MER联合SUL值得临床推广，但考虑AB耐药机制复杂，而且临床治疗受很多因素影响，所以仍需要进行动物或临床试验来评估该联合的治疗效果，进而选择合适的方案治疗MDR-AB感染。

作者贡献：豆姗姗进行文章的构思与设计、数据整理、统计学处理、结果的分析与解释、撰写论文、论文的修订；豆姗姗、陆思静进行研究的实施与可行性分析、对文章整体负责，监督管理；豆姗姗、艾阳进行数据收集。

本文无利益冲突。

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