林文科，吴吉芳，郑志昂

(海南省第三人民医院检验科，海南三亚　572000)

1　材料和方法

1.1研究对象选取2015年1月～2017年6月海南省第三人民医院经手术病理证实的NSCLC患者128例，其中男性82例，女性46例，年龄43～76岁，平均年龄58.4±9.7岁。纳入标准：①符合国际抗癌联盟(UICC)与2009年制定的最新版肺癌的诊断和分期标准，且经病理确诊为NSCLC者；②术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗者；③未并发其他肿瘤者。临床病理分期：I期16例，Ⅱ期50例，Ⅲ期34例，Ⅳ期28例；病理类型：鳞癌68例，腺癌51例，大细胞癌9例；病理分级：G1 28例，G2 47例，G3 53例；有淋巴结转移77例，无淋巴结转移51例。选择同期良性病变(如肺结核、炎性假瘤和各种肺部良性肿瘤等)患者60例作为良性组，其中男性39例，女性21例，年龄45～77岁，平均年龄60.2±10.4岁；60例健康体检者作为对照组，其中男性37例，女性23例，年龄40～75岁，平均年龄56.8±9.3岁。各组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，并签署患者知情同意书。

1.2主要试剂和仪器RNA提取试剂盒购自美国Ambio公司，在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)。C1000梯度PCR扩增仪(BIO-RAD公司)和5810R高速冷冻离心机(Eppendorf)。

1.3Real-Time PCR检测空腹取静脉血5 ml于EDTA抗凝管中，3 000 r/min，离心15 min后取上清，收集上清液于无RNA酶的2 ml离心管，所有标本置于-80℃冰箱保存。按照总microRNA快速提取试剂盒(miRNeasy血浆提取试剂盒)说明书从中提取总microRNA。以U6为实验内参，microRNA逆转录反应体系：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μl 100 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μl逆转录酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反转录缓冲液，0.19 μl RNase抑制剂(20 U/μl)，4.16 μl无菌三蒸水。PCR总反应体系为15 μl，反应条件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。以U6为实验内参，反应体系为20 μl：1 μl引物及探针Mix(20×)，10 μl TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μl反转录产物cDNA，7．67 μl 无核酸酶的水。扩……