初瑞， 栾岚，吴非，白阳，廖鑫，王翠芳*

（1沈阳医学院基础医学院研究生院，沈阳 110034；2沈阳医学院附属中心医院病理科，沈阳 110024）

胃癌是世界上最常见的癌症之一，是世界癌症相关死亡的第二大原因，而胃腺癌是胃癌的主要类型，尽管治疗方式有所创新，但胃腺癌患者的死亡率依然很高[1]。因此，有必要进一步研究胃腺癌的发生机制及分子基础，采取合理设计的分子靶向治疗，干预与细胞分化、增殖等相关的信号通路等措施[2]。Diversin，又称锚蛋白重复序列包含蛋白6（Ankrd6），是果蝇属Diego蛋白在哺乳动物中的同系物，但它们的结构和作用差异很大[3]。多项研究发现，diversin在多种肿瘤组织中存在高表达，而在癌旁及正常组织中低表达，并且diversin的高表达与患者不良预后相关。目前尚未见diversin在胃腺癌组织中表达的报道。本研究应用免疫组化方法检测胃腺癌及癌旁组织中diversin的表达及分析其与临床病理参数的关系，有助于进一步了解diversin在胃腺癌中的作用机制。

材料与方法

1 资料

收集沈阳医学院附属中心医院病理科经病理证实为胃腺癌的蜡块标本77例，标本中患者男性55例，女性22例，年龄37岁至83岁，平均年龄63岁；肿物平均大小3.0cm；有淋巴结转移者37例，无转移者40例；肿瘤浸润至固有层或黏膜下层15例，浸润至肌层16例，浸润至浆膜层46例；高-中分化胃腺癌35例，低分化胃腺癌42例；另取上述距胃癌组织≥5cm的非肿瘤性胃黏膜50例作为对照组。

2 主要试剂

鼠抗人diversin抗体（1:400）购于美国Santa Cruz公司；二抗（快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物），DAB显色试剂盒，粉剂型PBS缓冲液，粉剂型抗原修复液均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

3 EnVision两步法进行免疫组织化学染色

石蜡切片经烤片后，在二甲苯和梯度酒精中脱蜡和脱苯后水洗至透亮；高温高压修复后，PBS冲洗3×3min；加入内源性过氧化物酶阻断剂，每张切片大约100μL，室温孵育20min；PBS冲洗3×3min；加入一抗，每张切片约50μl，4℃冰箱内过夜；次日取出后恢复室温20min，PBS清洗3×3min；加入二抗，室温孵育15min，PBS冲洗3×3min；显微镜下DAB显色后自来水冲洗，苏木素复染、分化，自来水冲洗反蓝后放入梯度酒精内脱水，最后中性树脂封片。

4 结果判读

Diversin在细胞质中表达，阳性表达为棕黄色，由两名病理医师进行盲法评估，随机选取5个100倍视野按照阳性细胞百分比及染色强度二者之和评分，无染色(0分)，浅黄色(1分)，棕黄色(2分)，棕褐色(3分)；阳性细胞数：＜5% （0分），6%～25%（1分）， 26%～50%（2分）， 51%～75%（3分），＞75%（4分）。将阳性细胞百分比的计分与染色强度的计分相加，最后所得之和：＜2分为阴性，2～3分为弱阳性，4～5分为中度阳性，6～7分为强阳性。

5 统计学方法

应用SPSS 22.0统计软件进行χ2检验和相关性分析。

结 果

1 Diversin在胃腺癌组织高表达

免疫组织化学染色显示，diversin在胃腺癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达或不表达（图1）；其在胃腺癌组织中的阳性率为70% ，在癌旁组织中的阳性率为34%（表1）。

图1 Diversin在胃癌及癌旁组织表达的免疫组织化学检测。A，高分化；B，中分化；C，低分化；D，癌旁组织；比例尺，20μmFig. 1 Immunohistochemistry examination of diversin expression in gastric cancer and adjacent tissues. A, well differentiated cancer tissue; B, moderately differentiated cancer tissue; C, poorly differentiated cancer tissue; D, normal adjacent tissue; scale bar, 20μm

表1 Diversin在胃腺癌及癌旁组织中的表达Tab. 1 Expression of diversin in gastric carcinoma and adjecent tissues

2 Diversin在胃腺癌组织中的表达与各临床病理参数的关系

Diversin的阳性表达率在不同浸润深度、有无淋巴结转移及不同大小肿瘤中差别显著。在浸润深度这项指标中，肿瘤浸润至浆膜层（T3）组中diversin阳性表达39例（84.8%），显著高于diversin在固有层(T1)及肌层(T2)的阳性表达率（40%、62.5%）；在有淋巴结转移组diversin的阳性表达有30例（81.1%），无淋巴结转移组diversin阳性表达有24例（60%），diversin在有淋巴结转移组的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组；在肿瘤直径≥3cm的患者中diversin阳性表达42例（77.8%），而肿瘤直径＜3cm的患者diversin阳性表达11例（47.8%），diversin在肿瘤直径≥3cm组的阳性表达率明显高于肿瘤直径＜3cm组。在不同年龄、性别，分化程度中diversin的表达无明显差异（表2）。

表2 Diversin蛋白在胃腺癌组织中的表达与各临床病理参数的关系Tab. 2 Correlation of diversin expression with clinicopathological features of gastric cancer

讨 论

近年来，胃癌在我国消化道肿瘤的发病率排名一直居于高位，尽管治疗手段有所改进，但其死亡率仍然很高。胃腺癌是胃恶性肿瘤发病率最高的类型，其5年生存率仅20%左右，胃腺癌的发生发展受多种因素参与调控，且化疗等临床手段对胃腺癌患者的治疗效果不佳，所以寻找治疗胃腺癌的有效基因靶点至关重要[4]。

Diversin也称锚蛋白重复序列包含蛋白6（Ankrd6），小鼠diversin是由712个氨基酸所编码的蛋白质，它有3个功能域，分别是包含8个N末端锚蛋白重复域，保守的中心域和C末端结构域，人类的diversin蛋白与小鼠diversin蛋白很相似[5]。

Wnt信号通路包括经典Wnt信号通路，即Wnt/β-catenin通路，以及非经典Wnt通路，主要包括Wnt/Ca2+及Wnt/JNK通路。近年研究证明，Wnt信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关，包括结直肠癌，胃癌，肝癌等[6]。研究发现diversin与Wnt信号通路相关，其在经典Wnt信号通路中通过抑制降解复合体对β连环蛋白的降解，从而发挥抑制经典Wnt通路的作用[7]。在JNK通路中，diversin促进多种与形态发生相关的事件，包括原肠胚形成过程中的汇聚延伸运动，斑马鱼发育过程中心脏的形成，以及细胞培养过程中的血管发育等[8-9]。

Luan L等[10]研究发现diversin在非小细胞肺癌组织中高表达，在正常肺组织中低表达，且diversin在肺癌组织中的高表达与分化程度，淋巴结转移，TNM分期相关；与性别，年龄，组织类型不相关，且通过生存分析得知diversin阳性的非小细胞肺癌患者生存期明显低于diversin阴性的患者；Yu等[11]研究发现，diversin高表达于乳腺癌组织，低表达于正常乳腺组织中，且在乳腺癌中的高表达与TNM分期，淋巴结转移，ER受体及三阴性乳腺癌相关，与年龄，性别，肿瘤大小等不相关；Wang M等[12]研究发现diversin在人脑星形细胞瘤组织中高表达，并且与组织学分级相关，而与年龄，性别不相关；以上研究均发现高表达diversin的肿瘤组织中Wnt/JNK通路的关键蛋白JNK表达水平增高，而经典Wnt/β-catenin通路中的β-catenin等相关蛋白表达在对照组和实验组中的差别无统计学意义，提示diversin的作用

[1] Babacan NA, Reyhan EH, Birsen Y, et al. The Prognostic value of UHRF-1 and p53 in gastric cancer. Saudi J Gastroenterol, 2016, 22(1): 25-29.

[2] Badary DM, Abdel-Wanis ME, Hafez MZ, et al. Immunohistochemical analysis of PTEN, HER2/neu, and ki67 expression in patients with gastric cancer and their association with survival. Pathophysiology, 2017, 24(2): 99-106.

[3] Feiguin F, Hannus M, Mlodzik M, et al. The ankyrin repeat protein Diego mediates Frizzled-dependent planar polarization. Developmental Cell, 2001, 1(1): 93-101.

[4] 赵红岩，李红. 胃腺癌组织中LRIG1蛋白的表达及意义.肿瘤防治研究，2016，43（6）：489-491.

[5] Allache R, Wang M, De Marco P, et al. Genetic studies of ANKRD6 as a molecular switch between Wnt signaling pathways in human neural tube defects. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2015, 103(1): 20-26.

[6] Zhan T, Rindtorff N, Boutros M. Wnt signaling in cancer.Oncogene, 2017, 36(11): 1461-1473.

[7] Ikeda M, Hirota Y, Sakaguchi M, et al. Expression and pro-通路可能为JNK通路；diversin在胃腺癌中的表达及作用机制尚未见报道。

本研究中diversin在胃腺癌组织中高表达，在癌旁组织低表达，二者有显著差异（P=0.000）。浸润及转移是恶性肿瘤的基本特征，严重影响患者预后，本研究中diversin高表达者中有淋巴结转移患者的比率明显高于无淋巴结转移的患者；在浸润深度这项指标中，diversin高表达的患者浸润至浆膜层的比例高于浸润至固有层及肌层。由此提示，高表达diversin的胃腺癌患者可能预后不良。本研究结果为进一步探讨diversin作用的具体通路及作用机制奠定了基础，后续工作中我们将为diversin可能作为胃腺癌治疗的新的基因靶点提供更有力的证据。liferation-promoting role of Diversin in the neuronally committed precursor cells migrating in the adult mouse brain.Stem Cells, 2010, 28(11): 2017-2026.

[8] Chonnettia J, Dong Q, Myoung K S, et al. Ankrd6 is a mammalian functional homolog of Drosophila planar cell polarity gene diego and regulates coordinated cellular orientation in the mouse inner ear. Dev Biol, 2014, 395(1): 62-72.

[9] Moeller H, Jenny A, Schaeffer HJ et al. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci USA , 2006, 103(43): 15900–15905.

[10] Luan L, Zhao Y, Xu Z, et al. Diversin increases the proliferation and invasion ability of non-small-cell lung cancer cells via JNK pathway. Cancer Letters, 2014, 344(2):232-238.

[11] Yu X, Wang M, Dong Q, et al. Diversin is overexpressed in breast cancer and accelerates cell proliferation and invasion.PLoS One, 2014, 9(5): e98591.

[12] Wang M, Yu X, Dong Q, et al. Diversin is overexpressed in human gliomas and its depletion inhibits proliferation and invasion. Tumor Biol, 2014, 35(8): 7905-7909.