李娟，王开金*，程序

（1重庆市江津区中心医院呼吸科江津区呼吸疾病研究所，重庆402260；2四川省自贡市第四人民医院病理科，自贡643000）

肺癌是男性肿瘤死亡的主要原因之一，也是全球女性继乳腺癌后的第二位主要原因[1]。惊人的是，超过40%的患者确诊时即为肺癌晚期[2]。虽然肺癌有很多有效的治疗方法，包括手术、化疗、放疗、靶向治疗及综合治疗，但是肺癌患者的总生存率仍然很差[3]。因此，寻找更好的肿瘤分子标志物，使其在肺癌的诊断和治疗方面发挥价值。含Sushi重复蛋白X连锁2(Sushi repeat containing protein, X-linked 2, SRPX2)是一种新型的硫酸软骨素蛋白聚糖，最早在白血病细胞中发现[4]，随后在胃癌、胰腺癌及多种肿瘤细胞中存在过度表达[5,6]。本研究应用免疫组织化学方法，检测非小细胞肺癌组织中SRPX2的表达情况，分析其临床意义。

材料与方法

1 材料

选取2008年1月～2011年12月在江津区中心医院及四川省自贡市第四人民医院病理科保存NSCLC的石蜡标本93例及26例距离肿瘤边缘5cm以上的正常肺组织，术后病理明确诊断，所有患者术前均未接受放化疗治疗。根据癌症分期系统的美国联合委员会（AJCC）（第7版），I期31例，II期23例，III期39例；男性70例，女性23例；年龄＞60岁，40例，年龄≤60岁，53例；鳞癌50例，腺癌43例；高分化13例，中分化46例，低分化34例；不吸烟33例，吸烟60例；无淋巴结转移46例，有淋巴结转移47例。

所有患者均进行电话随访，术后2年内每3个月随访一次, 2年后半年随访一次，随访时间为5年。随访期间有5例失访。

2 主要试剂

兔抗人SRPX2多克隆抗体（Merck Millipore公司，德国），二抗SP试剂盒及DAB显色剂（北京中杉金桥生物公司）。

3 SRPX2免疫组织化学染色与结果判断

石蜡包埋组织标本连续切片，厚度4μm，常规脱蜡至水, 于0.01mmol/L（pH 6.0）枸橼酸盐缓冲液中进行微波热修复，按照SP试剂盒说明进行操作。兔抗人SRPX2多克隆抗体10μg/ml，37℃孵育2.5h，阴性对照用PBS液代替一抗，PBS 洗涤5min×3次,加生物素标记的二抗, 于37℃孵育15min。PBS洗涤3min ×3次，滴加根酶标记链霉卵白素一滴，37℃孵育15min，PBS洗涤5min×3次，DAB显色，自来水终止，苏木精复染，PBS代替一抗作阴性对照。SRPX2阳性表达定位于细胞质，随机选择10个高倍镜视野, 每个视野连续计数100个细胞。采用双评分半定量法[7]：①阳性细胞百分数得分：0（＜5%）；1（6%～25%）；2（26%～50%）；3（51%～75%）；4（＞ 75%）。②染色强度得分：0（无染色）；1（淡黄色）；2（黄棕色）；3（棕色）。上述两项得分相乘：0～2 分为阴性表达，3～9 分为阳性表达。所有切片均采用双盲法由两位病理科医师独立阅片。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料采取样本率表示，采取χ2检验；单因素生存分析采用Kaplan-meier生存曲线和log rank检验,均以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SRPX2在NSCLC及癌旁正常组织中的表达

SRPX2阳性表达定位于细胞质（图1），NSCLC组织中阳性表达率为52.7%（49/93），阴性表达率为47.3%（44/93），癌旁正常肺组织中未见到肺泡上皮细胞质着色，阳性表达率为0%（0/26），NSCLC组织中SRPX2的阳性表达率明显高于癌旁正常肺组织（χ2=23.288，P =0.000）。

图1 SRPX2在非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中表达的免疫组织化学检测。A，肺腺癌组织；B，肺鳞癌组织；C，癌旁组织； 比例尺，40µmFig. 1 Immunohistochemical examination of SRPX2 expression in non-small cell lung cancer and adjacent normal lung tissues. A, adenocarcinoma tissue; B, squamous cell carcinoma tissue; C, adjacent tissue; scale bar, 40µm

2 SRPX2的表达与NSCLC临床病理特征的关系

SRPX2的表达率与NSCLC的TNM分期及淋巴结转移相关（表1）。SRPX2在Ⅲ期中的阳性表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ期（χ2=12.654, P=0.000），在有淋巴结转移组织中的阳性表达率明显高于无淋巴结转移组织 (χ2=5.732，P =0.017)，而与患者性别、年龄、有无吸烟、组织学类型及分化程度无关。

表1 SRPX2的表达与NSCLC临床病理特征的关系Tab. 1 Correlation between SRPX2 expression and the clinicopathological characteristics of NSCLC

3 生存分析

Kaplan-Meier生存分析显示，SRPX2阳性表达的NSCLC患者平均生存时间为9.66个月，而阴性表达者为27.7个月（图2）。Log-rank 法检验统计量χ2=38.863, P=0.000。结果显示，SRPX2的表达与患者的生存率有关，SRPX2阳性表达的患者生存率明显低于表达阴性者。

图2 SRPX2阳性和阴性肺癌患者Kaplan Meier生存曲线Fig. 2 The Kaplan-Meier survival curves in SRPX2 positive and negative lung cancer patients

讨 论

癌细胞的局部微环境对癌症的发展起着重要的作用。微环境的主要组成部分是细胞外基质（extracellular matrix，ECM），一个复杂的大分子网络，主要包括糖蛋白、蛋白聚糖、胶原等，具有独特的物理、生化和生物力学性能。虽然胚胎发育和器官平衡过程受到严格控制，但是在一些疾病如癌症，ECM常常会放松管制，变得混乱。异常ECM通过直接促进细胞转化和转移影响癌症进展，但ECM异常也下调基质细胞行为，促进肿瘤血管生成和炎症反应，从而导致肿瘤微环境的产生。所以，了解ECM组成和结构的维持，其功能下调如何影响癌症进展，可能有助于开发新的肿瘤治疗的干预措施[8]。蛋白聚糖是细胞表面和细胞周围微环境的关键效应分子，在肿瘤和血管再生方面发挥多种功能，通过配体和受体之间相互作用调节肿瘤生长和血管再生[9]。

研究发现[5,6,10,11]，SRPX2在胃癌、胰腺癌、神经胶质细胞瘤过度表达。我们的研究也发现，NSCLC组织中SRPX2的阳性表达率明显高于癌旁正常组织。SRPX2的表达率与NSCLC的TNM分期有关，在胰腺癌组织中，也发现与TNM分期有关[10]。SRPX2在Ⅲ期中的阳性表达率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期。SRPX2的表达率与NSCLC的淋巴结转移相关，在有淋巴结转移组织中的阳性表达率明显高于无淋巴结转移的组织，而与患者性别、年龄、有无吸烟、组织学类型及分化程度无关。可见，SRPX2与NSCLC异常增殖和浸润转移有关。已发现，SRPX2过表达促进肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的相互作用，从而导致肿瘤的进展和转移。SRPX2促进神经胶质细胞瘤转移是通过MAPK信号通路，促进上皮细胞间质转型[11]；在胰腺癌，SRPX2通过FAK依赖途径促进细胞迁移和侵袭[10]；SRPX2可通过促进HUVECs的迁移及在Matrigel表面的管腔形成能力，增强其血管生成能力[12]。那么，在NSCLC中通过怎样的机制来实现还需要我们进一步研究。

SRPX2是肿瘤细胞株的预后标志物，与癌症患者的不良预后有关[11]。我们通过Kaplan-Meier生存分析显示，SRPX2阳性表达的NSCLC患者平均生存时间短于阴性表达者。SRPX2的表达与患者的生存率有关，SRPX2阳性表达的患者生存率明显低于表达阴性者。可见，SRPX2对NSCLC患者预后有一定的影响。

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer, 2015, 136(5):E359–386.

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