张 强， 李 彬， 李晓光， 游国超， 高 毅

兔VX2肿瘤模型制作方法多种多样，种植方式有开腹法及CT或超声导引下经皮穿刺种植法，瘤源包括细胞悬液或组织块。开腹种植法创伤较大，细胞悬液种植法靶器官外种植转移发生率较高，CT或超声导引下组织块种植法是目前常用的兔VX2肿瘤模型制作方法［1-2］。文献报道中多采用空芯穿刺针穿刺兔肝脏/肾脏，再经针尾将VX2组织块用针芯推入，存在植入组织块碎裂、大小不一、拔针时组织块移位、成瘤大小和位置均质性差等问题。为此，本研究对传统组织瘤块种植法进行改良，体外将浸润少量对比剂的明胶海绵条、肿瘤组织块逆向预装入穿刺针内，然后在CT导引下经皮穿刺靶器官，穿刺针到位后将组织块和明胶海绵条“一步”推送植入，较传统方法便捷省时、孤立成瘤率高。具体实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新西兰大白兔26只，雌雄不限，体重2～3 kg，由北京协和医院实验动物中心提供；VX2瘤株由中国医学科学院北京协和医学院基础研究所细胞中心提供。设备及器材包括前瞻性扫描2013型CT机（德国 Siemens公司）、Infinix-i INFX-8000 V 型DSA机（日本Toshiba公司）、16 G 8.5 cm种植穿刺针、一次性胸穿刺包（佛山特种医用导管公司）、18 G穿刺套管针针芯（头端磨平，作为种植穿刺针针芯）（美国Angiotech公司）、明胶海绵（广州市快康医疗器械公司）、2%利多卡因（5 mL：1 g，中国大冢制药公司）、3%戊巴比妥（美国Sigma公司）、肝素钠（2 mL：12 500 U，江苏万邦生化医药公司）、碘海醇注射液（350 mg I/mL，通用电气药业上海公司）。

1.2 种兔制作和组织块体外预装

将已冻存VX2瘤株组织迅速置于37℃水浴内融化、快速复苏，低温以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入适量磷酸缓冲液（PBS）摇匀，制成细胞悬液备用。取VX2细胞悬液1 mL接种于肿瘤传代兔后腿外侧最厚肌肉群内，2周后观察接种部位是否可触及肿块，并作增强CT扫描，进一步确认荷瘤兔制备是否成功。

3%戊巴比妥（1 mL/kg）经耳缘静脉麻醉荷瘤兔，肿块处备皮消毒，无菌条件下取出肿块，切开、去除中心坏死组织，取边缘生长旺盛的鱼肉样组织，用手术刀片切割成约l.0 mm×1.0 mm×3.0 mm组织块，置于无菌0.9%NaCl溶液中备用。将明胶海绵块修剪为1.5 mm×1.5 mm×3.0 mm长条状数条备用；取无菌16 G 8.5 cm胸穿刺针，剪除尾端连接管；将18 G穿刺针针芯头端磨平，消毒备用，于距离针芯头端 9.5 cm处作一标记。将明胶海绵条沿长轴捻动压缩，经穿刺针头端逆向填入针腔内约3 cm，用1 mL注射器抽取对比剂0.3 mL，注入穿刺针针腔内将明胶海绵条浸润；用注射器针头挑取肿瘤组织块1条，经穿刺针头端逆向填入针腔内，将组织块完全填入（组织块头端距离针尖斜面0.5～1 cm）；用无菌0.9%NaCl溶液纱布将穿刺针头端擦拭5～10次，去除针尖表面可能残留的肿瘤细胞，完成组织块预装，备用（图 1）。

1.3 兔VX2肝/肾肿瘤模型制作

图1 “体外预装示踪一步植入技术”

兔VX2肝肿瘤模型——实验兔耳缘静脉用3%戊巴比妥（1 mL/kg）麻醉后，仰卧位固定于操作台上，腹部备皮，消毒铺巾；CT扫描定位穿刺点，设计进针路线，取肝左叶外侧段为预接种部位；1%利多卡因2 mL作穿刺点局部麻醉，切开穿刺点皮肤约5 mm，用预装穿刺针沿预先设计进针路线穿刺入1.5～2 cm，CT扫描确定针尖部位，使之位于肝左叶实质中部；位置合适后经穿刺针尾端缓慢推送针芯至标记处并保留30 s，随后缓慢旋转并整体拔出穿刺针，穿刺点按压1 min，再次消毒。术后即刻CT扫描确定高密度明胶海绵位置，预判种植部位。兔VX2肾肿瘤模型——实验兔麻醉后，俯卧位固定于操作台上，背部备皮，消毒铺巾，CT扫描定位穿刺点，设计进针路线，取肾下极为种植部位；1%利多卡因2 mL作穿刺点及穿刺针道局部麻醉，切开穿刺点皮肤约5 mm，用预装穿刺针沿预先设计进针路线穿刺入2～2.5 cm，CT扫描确定针尖部位，使之位于肾下极内；位置合适后经穿刺针尾端缓慢推送针芯至标记处并保留30 s，随后缓慢旋转并整体拔出穿刺针，穿刺点按压1 min，再次消毒。术后即刻CT扫描确定高密度明胶海绵位置，预判种植部位。

术毕记录植瘤时间（局部麻醉开始至拔针完成所用时间）。实验兔自然清醒，送动物房饲养。2周后作增强CT扫描检查，明确有无肿瘤生长，并与预判种植部位对比，明确肿瘤生长部位与预接种部位是否一致。3周后再次CT增强扫描检查，明确肿瘤生长特点。取两模型实验兔各1只作肝、肾肿瘤组织学检查，常规苏木精-伊红（HE）染色。后续经兔隐动脉入路分别行肝、肾肿瘤栓塞［3］，观察肝、肾VX2肿瘤造影表现。

1.4 随访观察

接种后2周对种兔模型作CT平扫和增强扫描（管电压 80 kVp，管电流 120 mAs，层厚 2 mm，矩阵512×512，照射野150 mm）——肝脏3期扫描，动脉期延迟6 s，门静脉期31 s，延迟期37 s；肾脏2期扫描，动脉期延迟8 s，延迟期31 s——对比剂经22 G静脉留置针经耳缘静脉注入（剂量1 mL/kg，速率1.5 mL/s，压力100 psi）。将CT成像传送至Syngo工作站，分别检测肿瘤矢状面、横断面及冠状面最大径，采用“Oncology”及“Volume”软件测定不同层面径线，记录肿瘤体积。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件作统计学处理，所得数据以均数±标准差（±s）表示。

2 结果

2只实验种兔制作均成功，2周后种植部位可触及肿块，质硬。CT见种植部位肌肉内类圆形强化肿块，直径约1.5 cm，周边强化明显。肝肿瘤接种10只兔，接种均获成功，无感染及死亡发生；植瘤时间3.5～5.5 min，平均4.3 min。肾肿瘤接种10只兔，接种成功9只（9/10），无感染及死亡发生。植瘤时间4.3～6.5 min，平均 4.9 min。

肝肿瘤生长区与对比剂标记的高密度明胶海绵区基本一致。2周CT平扫表现为肝内单发类圆形低密度病灶，动脉期周边环状强化，门静脉期肿瘤周边强化环密度逐渐减低，呈向心性强化趋势，但不能完全使病灶强化，平衡期瘤周强化环密度进一步减低，中心可见未强化低密度区；3周病变明显增大，强化特点与2周时相同，但中心未强化区明显增大（图2①～③）；4周出现肝肺转移播散。随访期间无穿刺针道及肝外种植转移发生，DSA检查表现为肝内单发病变，类圆形，病变周边染色明显（图2④）。组织学检查显示肿瘤细胞核大深染，侵犯邻近正常肝组织（图2⑤）。VX2肝肿瘤径线及体积变化见表1。

肾肿瘤生长区与对比剂标记的高密度明胶海绵区基本一致。2周时CT平扫肿瘤轮廓显示不清，动脉期表现为肾下极单发占位性病变，强化不明显，表现为肾皮质连续性中断或皮质缺损；延迟扫描肿瘤边界清楚、密度较肾实质低、类圆形，周边轻度强化，中心强化不明显，占位效应明显，邻近肾盏受压变形，重建图像显示病变位于肾实质内，未突破肾包膜；3周病变明显增大，占位效应明显，中心未强化区扩大，肿瘤突破肾皮质外生（图3①～③）；4～5周肿瘤突破肾包膜，侵犯邻近筋膜并出现肺转移。DSA检查表现为肾下极实质内染色缺损区，占位效应明显（图3④）；组织学检查显示2周时肿瘤细胞核大深染，瘤组织未突破肾包膜（图3⑤）。VX2肾肿瘤径线及体积变化见表2。

图2 VX2肝肿瘤种植影像及组织学随访结果

表1 VX2肝肿瘤径线及体积随时间变化 ±s

表1 VX2肝肿瘤径线及体积随时间变化 ±s

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表2 VX2肾肿瘤径线及体积随时间变化 ±s

表2 VX2肾肿瘤径线及体积随时间变化 ±s

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3 讨论

图3 VX2肾肿瘤种植影像及组织学随访结果

VX2肿瘤模型种植方法多种多样［4-13］。既往多采用细胞悬液法制备，但操作过程繁琐，最主要是易发生转移和针道种植，使造模失败，故不适合介入放射学动物实验研究。目前多采用组织块种植法，其简便，易于成瘤，孤立成瘤率较高。开腹种植法创伤较大，而腹腔镜种植法需要专门器械及操作技能。因此，影像设备导引下经皮穿刺组织块种植法是目前常用造模方法［7-8，10，12］。

既往报道影像导引下经皮穿刺组织块种植法多采用“后装技术”，即穿刺针到位后再将组织块及明胶海绵块经穿刺针尾部缓慢推入。但该方法有以下缺点：组织块在针腔内移行距离长，与针腔内壁摩擦，可能损伤部分组织；“后装技术”耗时且不便捷，装填组织块时需要固定穿刺针，穿刺针随实验兔呼吸可能在体内移位，从而使种植部位发生移位，特别是对体积相对小的脏器如肾脏，更易发生穿刺针移位，导致植瘤失败。为此，本实验改进该方法，采用“体外预装示踪一步植入技术”——先体外逆向将明胶海绵条填入穿刺针内，并用对比剂浸润明胶海绵，起示踪作用，后再逆行填入修剪好的组织块1条于针腔内，预装完成后反复擦拭穿刺针尖部，去除表面可能残留的组织块碎屑或细胞。采用预装好的穿刺针直接穿刺，穿刺针到位后可快速将组织块推送入靶器官，耗时明显减少，且组织块在针腔内移行距离明显缩短，降低了组织块损伤及组织碎屑脱落概率，进而降低移位种植风险。

与VX2肝肿瘤模型近似，超声及CT导引下组织块种植法也是较为理想的VX2肾肿瘤模型制作方法［13-16］，成瘤率为 40%～100%［17-18］。由于肾脏较肝脏小，影像导引下种植较肝脏困难，准确判定针尖位置至关重要；CT较超声有较高的组织分辨率和空间分辨率，采用CT导引下组织块种植，即刻CT扫描即可显示肿瘤种植部位是否理想。本实验肾肿瘤种植成瘤率90%（9/10），均为单发成瘤，无肾外种植发生，2周肿瘤主要位于肾实质内。因此，该方法是理想的兔VX2肿瘤模型制作方法。

本实验采用 “体外预装示踪一步植入技术”制作兔VX2肝/肾肿瘤模型，优点在于肿瘤组织块已预装好，穿刺针位置理想后即可用针芯推送，可减少穿刺针在体内滞留时间及移位概率，缩短手术时间，术后可即刻了解肿瘤种植部位，便捷有效；结果显示肿瘤生长区与对比剂标记的高密度明胶海绵区基本一致。浸润对比剂的明胶海绵条既起到示踪作用，又可封堵穿刺针道，防止出血和组织块在拔针时移位于靶器官外，发生种植转移。本实验采用大小长度基本一致的单一组织块种植，与既往报道相比增加了组织块长度，未增加组织块数量，结果均可成瘤，且为孤立种植瘤，2～3周随访无靶器官外种植转移。种植瘤大小和位置均一性好，更加适合进行肝/肾肿瘤经导管动脉栓塞或经皮消融实验研究。

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