刘文贵， 戴国梁， 司海鹏， 汪有锦， 马 坤， 沈湘蕾， 汪 维

介入治疗肝脏恶性肿瘤中无论是经肝动脉给药首过效应，还是穿刺瘤体直接注射药物，均旨在增加肿瘤局部药物浓度，减少全身不良反应［1-5］。有些药物如氟尿嘧啶脱氧核苷经肝动脉灌注后除了首过效应，还由于肝脏对此类药物代谢特点而产生首过清除效应。经肝动脉灌注氟尿嘧啶脱氧核苷后94%～99%滞留肝内，使正常肝细胞及肿瘤细胞内药物浓度分别相当于外周静脉同等量给药后相应细胞药物浓度的15倍和近400倍［2-4］。雷替曲塞是一种喹唑啉叶酸盐类似物，经还原叶酸盐载体系统摄入细胞，在叶酸多聚谷氨酸合成酶作用下迅速代谢为一系列多聚谷氨酰化合物，作用于胸苷酸合成酶（TS）靶点叶酸结合部位，特异性地抑制TS活性而发挥抗肿瘤作用［6-7］；其抑制作用是二氢叶酸还原酶的100倍，上市以来主要被推荐应用于不耐受或不适用5-氟尿嘧啶联用亚叶酸钙的晚期结直肠癌治疗，在肝癌治疗领域研究甚少［8-9］，仅见少量关于介入途径给药治疗肝脏肿瘤的回顾性研究［10-12］。尚未见经多种介入途径给予雷替曲塞对肝脏功能、肝脏组织学及药代动力学（药动学）影响的对照实验研究。临床等效剂量雷替曲塞通过介入放射学方法给药的效应及安全性如何，经静脉、动脉或直接穿刺注射各有哪些应用优势，本研究就这些问题进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验器材

取饲养于南京医科大学实验动物中心普通清洁级新西兰大白兔25只（购自南京安立默科技公司，合格证号：SCXK苏-2010-0002），雌雄不限，体质量2.7～3.1 kg。实验兔符合国家有关实验动物保护规范和管理条例，动物实验研究符合赫尔辛基宣言。实验器材包括自制木质手术台3张、静脉留置针、常规开腹手术器械、精细手术器械（精细镊子、手术剪、玻璃分针等）、介入穿刺套件、2.7 F Progret微导管套件等（日本Terumo公司）、GE128排螺旋CT机（美国通用公司）、平板DSA机（日本岛津公司）、RM2235型切片机、ST 5020型自动染色机、CV5030型封片机（德国Leica公司）、高效液相色谱仪等。实验药物为2%戊巴比妥钠溶液 （现场配制）、肝素（12 500 U/mL）、碘佛醇 300（江苏恒瑞医药公司）、雷替曲塞注射液（南京正大天晴制药公司）、青霉素G钠80万U/支、4%甲醛、0.9%NaCl溶液等。

1.2 实验方法

分组给药：所有操作均在介入DSA室或CT室进行。将25只实验兔随机分为外周静脉注射组（A组）、肝动脉灌注组（B组）、肝动脉碘化油栓塞组（C组）、肝动脉明胶海绵颗粒栓塞组（D组）及肝脏直接穿刺注射组（E组），每组5只。实验前所有实验兔禁食、禁水12 h。实验时予一侧耳缘静脉留置针（22 G），抽取1 mL血液用于检测给药前肝功能。以2%戊巴比妥钠溶液经留置针推注麻醉实验兔，并给予适量补液。A组经此留置针注射雷替曲塞；B、C、D组肝动脉插管采用股动脉入路［13］（图1），微导管到位后根据实验设计要求分别行经动脉灌注雷替曲塞、雷替曲塞+碘化油乳剂栓塞、雷替曲塞+明胶海绵颗粒栓塞；E组CT定位下肝脏穿刺（图2），穿刺针到位后直接注射雷替曲塞。每只兔均经不同途径或方式在约6 min内［14］接受临床等效剂量雷替曲塞注射液（0.17 mg/kg体质量）。

血液及组织学取材：经实验兔颈静脉［13］抽取给药后 5、15、30、60、120、180 min 静脉血 1 mL，离心后取上清液用于检测血药浓度；给药后6 h，抽取实验兔1 mL静脉血用于肝功能检测，然后以空气栓塞法处死每组2只实验兔，摘取其肝脏制作组织学标本。剩下实验兔送动物房饲养，1周后以同样方法检测肝功能及制作肝脏组织学标本。

图1 经股动脉途径行肝动脉插管造影

图2 CT扫描定位行肝脏穿刺

血药浓度检测由本院临床药理基地具有多年工作经验的药理研究员（D.G.L）完成；所有组织学取材及分析均由同一位病理科副主任医师（S.H.P）完成：将肝脏组织用4%甲醛溶液充分固定后，切开组织，目视下切取感兴趣区组织块（大小约2 cm×1.5 cm），经脱水、透明、浸蜡、包埋后切片（厚度3 μm），放入自动染色机完成染色、封片，光镜下观察组织学变化。

1.3 统计学处理

将实验数据录入Excel工作表，对其中连续性变量进行均数±标准差（±s）描述性统计分析，对分类数据以百分数表达。采用SPSS软件包对数据进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

组间实验兔在性别、体质量等方面差异均无统计学意义（P＞0.05）。B组1只实验兔在动脉插管过程中行补充麻醉后意外死亡；C组1只兔术后第2日死亡，无其它兔死亡。

2.2 给药前后肝功能变化

给药前后肝功能变化见表1，C、D、E组实验兔给药后6 h血清天冬氨酸转氨酶（AST）、谷氨酸转氨酶（ALT）与给药前相比，差异均有统计学意义（P＜0.01），以C组为著，给药后1周时这些指标大部分恢复接近正常；A组或B组实验兔相应指标与给药前相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 实验兔给药前后血清肝功能变化 U/L

2.3 药动学变化

给药后 5、15、30、60、120、180 min 时实验兔外周血药浓度（μg/mL）在 A 组分别为 0.91、0.46、0.33、0、0、0，B 组分别为 1.73、1.27、0.86、0.62、0.53、0.37，C 组分别 为 0.82、0.48、0.37、0.24、0.10、0.08，D 组分别为 0.94、0.49、0.36、0.18、0.15、0.08，E 组分别为0.39、0.25、0.18、0.13、0、0。 各组实验兔给药后外周血药浓度变化趋势见图3。实验兔肝脏组织学变化显示，给药6 h后A组肝细胞在光镜下表现为轻度水肿变性（图4②），1周后镜下见汇管区小胆管轻度增生，伴少量炎性细胞浸润，而肝细胞形态已恢复正常；B组肝脏可见少量灶性坏死，肝细胞明显水肿（图4③），1周后镜下见汇管区小胆管增生及炎性细胞浸润程度也明显强于外周静脉组，但肝细胞形态已基本恢复正常；C组肝组织呈多灶、小片状凝固性坏死，肝细胞明显水肿（图4④），1周后小胆管增生及炎性细胞浸润明显强于B组，并出现脂肪变性，肝细胞水肿已消退，但仍见坏死灶（图4⑦）；D组肝细胞急性水肿及坏死程度轻于C组（图4⑤），1周后汇管区小胆管增生、炎性细胞浸润及脂肪变性程度也弱于C组，栓塞区仍见片状凝固性坏死区（图4⑧）；E组肝组织呈大片状凝固性坏死，肝细胞呈气球样水肿 （图4⑥），1周后汇管区小胆管增生、炎性细胞浸润及脂肪变性弱于C、D组，肝细胞水肿与凝固性坏死并存（图4⑨）。

3 讨论

图3 给药后实验兔血药动学变化（颈静脉取血）

经肝动脉灌注化疗是利用肝脏对某些药物的首过效应或首过清除效应［2-5］。经导管动脉化疗栓塞术（TACE）已成为治疗不可切除肝脏恶性肿瘤的标准方法，术中常用碘化油除作为栓塞剂栓塞肿瘤血管，还作为化疗药物载体起到靶向、缓释化疗的作用［2-5］。药物洗脱微球（DEM）TACE同样是通过对富血供病灶超选择插管和栓塞，使微球携带药物缓释后显著延长与病变接触时间，减少全身药物总剂量［1-4，14-15］。 然而对乏血供、无法行超选择插管的肿瘤，介入法局部穿刺注射给药不失为一种理想手段［3-5，15］。

图4 给药后实验兔肝脏组织学变化

雷替曲塞疗效与药物浓度呈正相关。该药通过细胞膜还原型叶酸/甲氨蝶呤载体被细胞主动摄取后，在细胞内被叶酸基聚谷氨酸合成酶代谢为一系列多聚谷氨酸类化合物，并能在细胞内潴留，特异性地抑制TS活性并具有超长作用时间（半衰期长达 198 h）［6-7，10-12］。如果雷替曲塞和氟尿嘧啶脱氧核苷一样经肝动脉灌注后具有显著的首过效应和首过清除效应，将是治疗肝脏肿瘤的理想药物，但也不得不关注其对正常肝组织的损伤。本研究发现雷替曲塞经静脉注射5 min后已分布全身循环，全身细胞主动摄取后颈静脉血药浓度迅速降低（本研究检测血中雷替曲塞原药，非细胞内代谢后成分），而经肝动脉灌注同等剂量雷替曲塞5 min后颈静脉内血药浓度约为静脉注射的2倍，说明肝脏对此药无首过清除效应，但由于药物首过效应，肝区药物不断随循环到达颈静脉，3 h后血药浓度仍与静脉给药后30 min药物浓度相当。碘化油或明胶海绵颗粒混合雷替曲塞后栓塞，显示有明显缓释效应，给药后5 min时血药浓度仅为肝动脉灌注组50%，且给药后3 h仍可检测到缓释药物。肝脏直接穿刺注射药物则明显提高了局部药物浓度，因为药物渗入血液循环很慢，60 min后同样也难以检测药物浓度。

肝功能和肝脏组织学变化同样可反映经不同途径给予雷替曲塞后对肝脏产生的效应。动脉灌注无明显首过清除效应，肝脏内首过效应带来药物浓度增加，主要以导致肝细胞炎性水肿为主，肝细胞坏死少见，因此肝酶谱升高不显著，但碘化油或明胶海绵栓塞肝脏血管，导致肝细胞缺血，加上其缓释作用导致局部持续高浓度药物，使大量肝细胞凝固性坏死，肝酶谱升高。局部穿刺注射药物仅在肝脏局部渗透，导致局部药物浓度很高，肝细胞水肿坏死显著，但损伤范围较局限，因此释放入循环的转氨酶不多。

需要特别提出的是，碘化油为末梢性永久栓塞剂，其栓塞有效管径为50 μm，而明胶海绵颗粒粒径多在350～800 μm，因此C组实验兔肝细胞坏死程度要比D组严重。此外，本实验为非荷瘤预实验，考虑到实验兔需要存活、肝动脉超选择插管困难等因素，均将微导管选择性插至肝固有动脉，对肝脏行弥漫性栓塞，因此栓塞剂剂量比临床治疗肿瘤超选择插管后所用剂量保守得多。人体血管相对兔血管，超选择插管栓塞要容易得多，且通常追求致密栓塞，使肿瘤坏死效应更加显著。但如果临床治疗过程中不能超选择插管，将等剂量药物灌注或栓塞至较小肝区，由于首过效应，肝细胞得以较长时间主动摄取雷替曲塞并在细胞内大量蓄积，加上其超长半衰期，对正常肝组织损伤效应值得关注。本研究通过肝功能、组织学及药动学变化检测已能提示这种效应。本研究认为，可根据插管程度及肿瘤大小适当调整雷替曲塞及栓塞剂用量，尤其以雷替曲塞总剂量小于静脉给药推荐量为宜。

本研究不足之处：①未用其它药物作对照实验。实验初期已设计雷替曲塞与榄香烯脂质体平行对照，但研究经费等原因，实验被分拆进行，有待今后在荷瘤动物实验中对照进行。②样本量不足、未行超选择插管、未行致密栓塞，使得肝功能和组织学变化间不匹配、未设立单纯碘化油及明胶海绵栓塞组、未设计正常肝组织对雷替曲塞浓度耐受梯度等。

综上所述，经动脉灌注临床等效剂量雷替曲塞显示有明显的首过效应。临床上经肝动脉或直接穿刺注射雷替曲塞，应根据插管程度及肿瘤大小调整应用剂量。

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