林晓芳 姚新苗 李威 陈贤彪 方芳

浙江中医药大学第三临床医学院 杭州 310053

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种与年龄相关的慢性虚弱性骨骼疾病，其特征在于骨量的丢失和骨微结构的变化，导致脆性骨折的发生率增加[1]。据估计，40%的绝经后妇女在生活中将至少经历一次骨质疏松性骨折[2-3]，其中髋部骨折的发生率随着年龄的增长呈指数级增长[4]。目前临床上治疗OP的药物包括雌激素类药物[5]、双膦酸盐[6]、降钙素、选择性雌激素受体调节剂[7]、重组人甲状旁腺激素、维生素D类似物和依普黄酮等[8]。这些药物的作用机制多是减少骨吸收、促进骨形成和促进骨矿化，这仅增加了骨密度（bone mineral density，BMD），却不能改善骨质量与骨强度，因而无法有效降低骨折发生率[9]，且大多存在一些副作用[10]，限制了临床应用。

近年来的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在骨发育中起关键作用，已经成为OP治疗的潜在靶点[9]。Wnt/β-catenin 信号通路主要由细胞外因子（Wnt）、β-链蛋白（β-catenin）、Runt相关转录因子 2（Runtrelated transcription factor2，Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（Osterix，OSX）组成，而 Dickkopf相关蛋白 1（Dickkopf1，DKK1）是 Wnt/β-catenin 信号通路的特异性抑制剂。笔者所在的研究团队长期从事OP的相关研究，研发的益骨汤（组方为骨碎补、淫羊藿、补骨脂、丹参、生地、山药）经临床研究证实能显著改善原发性OP患者的疼痛症状，且未观察到明显的副作用[11]；动物实验证实能提高实验性OP模型大鼠的载荷及痛域[12-13]，上调经典Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin基因的表达[14]，但益骨汤具体的作用机制尚不明确。

本研究以切除卵巢的Wistar大鼠为研究对象，测定大鼠右侧股骨BMD，并检测骨组织中Wnt/βcatenin信号通路相关蛋白的基因及蛋白表达量，探究益骨汤防治OP的作用机制，为益骨汤在临床上的推广应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 动物 12周龄清洁级雌性Wistar大鼠44只，体质量（220±10）g，均由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪）2013-0016，合格证编码：2013001806499。大鼠饲养于浙江中医药大学动物实验中心，实验室设施许可证号：SYXK（浙）2013-0184。饲养室保持良好通风，室温控制在（21±1）℃，湿度63%，噪音≤55分贝，自由摄食、饮水，光照与黑暗时间每12h交替。

1.2 药物 戊酸雌二醇片（商品名：补佳乐）购自拜耳医药保健有限公司广州分公司（批号：J20130009）；益骨汤包含骨碎补、淫羊藿、补骨脂、丹参、生地、山药6味中药，均购于浙江中医药大学附属中山医院，依据姚新苗等[15]研究中制备方法熬制成原生药浓度为2g·mL-1的水提液。

1.3 仪器及试剂 DPX-L型双能X线骨密度仪购于美国Lunar公司；Agilent Stratagene Mx3005P定量PCR仪为美国安捷伦公司产品；Mini Electrophoresis system电泳系统购于美国Bio-RAD公司；Tanon GIS凝胶图像处理系统购于上海天能科技有限公司。总RNA提取试剂盒购于杭州宝赛生物科技有限公司（批号：RE02050）；反转录试剂盒购于杭州宝赛生物科技有限公司（批号：RT02020）；DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司（批号：SA2023）；荧光定量试剂盒购于杭州宝赛生物科技有限公司（批号：PM10003）；总蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物有限公司（批号：KGP250）；BCA蛋白定量试剂盒购于天根生物科技有限公司（批号：PA115-1）；抗Wnt10b抗体购于Abcam公司（批号：ab70816）；抗β-catenin抗体购于Proteintech公司（批号：51067-2-AP）；抗Runx2抗体购于Abcam公司（批号：ab133261）；抗OSX抗体购于Abcam公司（批号：ab94744）；抗Actin抗体购于Abcam公司（批号：ab8227）；山羊抗兔抗体购于Abcam公司（批号：ab97200）。

1.4 模型制备及分组 按数字随机表法将大鼠随机分为正常组、模型组、补佳乐组、益骨汤组4组，每组11只。氯氨酮（5g·100g-1）腹腔注射麻醉后，模型组、补佳乐组、益骨汤组大鼠切除双侧卵巢，术后3d，每只去势大鼠予青霉素4万U/d肌肉注射，预防感染。正常组大鼠不作任何处理。建模成功率100%，各组术后均无大鼠死亡。

1.5 干预方法 术后各组大鼠以常规饲料喂养12周，第13周开始给药，正常组与模型组以双蒸水10mL·kg-1灌胃；补佳乐组将0.36mg补佳乐片溶解于10mL 双蒸水，再按 10mL·kg-1灌胃给药[16]；益骨汤组以益骨汤水提液10mL·kg-1灌胃[17]，各组均为1次/d，共12周。

1.6 取材 12周后处死大鼠，取右侧股骨，各组分别选取6只大鼠的右侧股骨用于BMD测定，BMD测定完毕后迅速转入液氮，用于Western blot及实时荧光定量PCR检测。其余5只大鼠的右侧股骨以10%甲醛固定，置于10%EDTA溶液内脱钙，乙醇脱水，取股骨干骺端骨组织，用于病理学观察及免疫组化检测。

1.7 指标检测

1.7.1 BMD测定 各组分别选取6只大鼠，采用双能骨密度仪测定右股骨干骺端BMD值，单位g/cm2。

1.7.2 骨组织病理学观察 常规石蜡包埋，5μm切片后行HE染色，光镜下观察。

1.7.3 实时荧光定量PCR检测Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达 Trizol一步法提取大鼠股骨骨组织中总RNA，依据试剂盒说明进行逆转录。逆转录条件42℃ 45min，70℃ 10min。荧光定量PCR按照试剂盒说明进行，反应条件为94℃ 1min，95℃ 10s，58℃10s，72℃ 10s，共40个循环。采用β-actin作为内参，以正常组为参照组，根据2-△△Ct法计算获得各基因相对表达量。上海捷瑞生物工程有限公司设计的引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7.4 免疫组化检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达 每组选取5只大鼠的标本，每只大鼠选3张石蜡切片，烘箱中65℃烤片2.5h，二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ脱蜡各15min，无水乙醇清洗二甲苯，逐级梯度乙醇浸泡5min，PBS溶液中清洗3次，每次3min，10%牛血清白蛋白室温封闭30min，PBS清洗，一抗（1:100）4℃孵育过夜，山羊抗兔（1:400）室温避光孵育2h，DAB显色，晾干，封片。于200倍光镜下观察，每张切片随机选取3个视野，用Image-ProPlus 6.0分析软件进行图像分析，测定积分光密度（integral optical density，IOD），以IOD值代表蛋白表达量。

1.7.5 Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达 各组大鼠右股骨标本超声粉碎后加入含1%PMSF-RIPA的裂解液，冰上裂解 30min，BCA法测定蛋白浓度。蛋白100℃变性3min，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转印45min，5%脱脂奶粉封闭1h，一抗（1:500）4℃孵育过夜，二抗（1:1 000）室温孵育1h，ECL曝光，Mini Electrophoresis system凝胶图像处理系统扫描测定灰度值，计算条带的平均光密度值，以目的条带平均光密度值与内参条带平均光密度值的比值代表蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多样本均数组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，采用LSD-t法，方差不齐时采用Dunnettt’s T3法，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠股骨BMD比较 与正常组比较，模型组大鼠BMD降低（P＜0.01）。与模型组比较，补佳乐组、益骨汤组 BMD 均升高（P＜0.05，P＜0.01），与补佳乐组比较，益骨汤组BMD升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），说明补佳乐、益骨汤均能改善去势大鼠低BMD状态，且两者无明显差别。见表2。

表2 各组大鼠股骨BMD比较（g/cm2，±s）Tab.2 Comparison of BMD in femur of the rats(g/cm2，±s）

表2 各组大鼠股骨BMD比较（g/cm2，±s）Tab.2 Comparison of BMD in femur of the rats(g/cm2，±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

组别n 股骨BMD正常组模型组补佳乐组益骨汤组6 6 6 6 0.247±0.049 0.169±0.031**0.218±0.015#0.236±0.320##

2.2 各组大鼠股骨骨组织病理学观察 光镜下可见，正常组骨小梁形态结构完整，排列紧密、有规则，骨小梁间连接呈网状，骨髓腔相对较小；模型组骨小梁结构排列稀疏，总量明显减少，骨小梁间连接性差，出现大量骨小梁盲端，骨小梁壁厚度不一致，骨髓腔增大；补佳乐组与益骨汤组可见骨小梁粗壮、饱满，骨髓腔相对于模型组减小。见图1。

图1 各组大鼠右侧股骨骨组织病理学观察（HE染色，100×）Fig.1 Pathology observation on right femur of the rats(HE staining，100×)

2.3 各组大鼠股骨骨组织Wnt信号通路相关基因表达比较 与模型组比较，补佳乐组Wnt10b、β-catenin基因表达量升高（P＜0.01，P＜0.01），益骨汤组Wnt10b、β-catenin、Runx2 基因表达量升高（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），DKK1基因表达量降低（P＜0.05）。与补佳乐组比较，益骨汤组Wnt10b、β-catenin、Runx2基因表达量升高（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05），表明补佳乐与益骨汤均能激活大鼠股骨组织中Wnt10b、β-catenin基因的表达，且益骨汤的效果优于补佳乐。益骨汤还可激活Wnt/β-catenin信号通路中Runx2的表达，抑制DKK1的过表达。见表3。

表3 各组大鼠股骨骨组织 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX、DKK1 基因表达（±s）Tab.3 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX，DKK1 mRNA in femur of the rats(±s)

表3 各组大鼠股骨骨组织 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX、DKK1 基因表达（±s）Tab.3 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX，DKK1 mRNA in femur of the rats(±s)

注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与补佳乐组比较，△P＜0.05。Note:Compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01；compared with the progynova group，△P＜0.05.

组别 Wnt10b β-catenin Runx2 OSX DKK1模型组补佳乐组益骨汤组0.221±0.093 0.568±0.136##0.777±0.0873##△0.067±0.025 0.188±0.029##0.242±0.0483##△0.192±0.057 0.563±0.138 0.993±0.492##△0.436±0.214 0.649±0.207 1.048±0.756 2.877±1.012 2.117±0.849 1.944±1.089#

2.4 免疫组化检测各组大鼠股骨组织Wnt信号通路相关蛋白表达 免疫组化检测提示，与正常组比较，模型组 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 的 IOD 降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。与模型组比较，补佳乐组 Wnt10b、β-catenin、OSX 的 IOD 升高（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），益骨汤组 Runx2、OSX 的 IOD 升高（P＜0.05，P＜0.05），Wnt10b、β-catenin 的 IOD 也有升高趋势，但差异并无统计学意义（P＞0.05）。与补佳乐组比较，益骨汤组 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 的IOD差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明补佳乐能增加去势大鼠 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 的蛋白表达，而益骨汤能增加去势大鼠Runx2、OSX的蛋白表达，但对Wnt10b、β-catenin表达无明显影响。见表4、图 2-5。

表4 各组大鼠股骨骨组织中Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX蛋白表达（±s）Tab.4 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2 and OSX protein in femur of the rats(±s)

表4 各组大鼠股骨骨组织中Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX蛋白表达（±s）Tab.4 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2 and OSX protein in femur of the rats(±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with the normal group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

组别 n Wnt10b β-catenin Runx2 OSX正常组模型组补佳乐组益骨汤组5 5 5 5 15.00±5.33 9.40±1.98*17.42±2.08##15.84±4.27 38.68±3.92 17.44±7.58**30.44±11.18#27.09±7.33 21.86±11.36 1.59±0.68**11.45±3.20 16.34±4.30#17.92±4.55 10.44±1.56*20.10±3.32##18.41±3.68#

图2 各组大鼠股骨骨组织中Wnt10b蛋白表达（200×）Fig.2 Expression of Wnt10b protein in femur of the rats(200×)

图3 各组大鼠股骨骨组织中β-catenin蛋白表达（200×）Fig.3 Expression of β-catenin protein in femur of the rats(200×)

图4 各组大鼠股骨骨组织中Runx2蛋白表达（200×）Fig.4 Expression of Runx2 protein in femur of the rats(200×)

图5 各组大鼠股骨骨组织中OSX蛋白表达（200×）Fig.5 Expression of OSX protein in femur of the rats(200×)

2.5 Western blot检测各组大鼠股骨骨组织Wnt信号通路相关蛋白表达 Western blot检测提示，与正常组比较，模型组 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 蛋白表达量降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。与模型组比较，补佳乐组 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX蛋白表达量升高（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），益骨汤组 Runx2、OSX 蛋白表达量升高 （P＜0.01，P＜0.01）。与补佳乐组比较，益骨汤组 Wnt10b、βcatenin、Runx2、OSX蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。说明补佳乐、益骨汤均能提高去势大鼠股骨组织中Runx2、OSX蛋白表达量，且补佳乐能提高去势大鼠股骨组织中Wnt10b、β-catenin蛋白的表达量，而益骨汤对去势大鼠股骨组织中Wnt10b、β-catenin的蛋白表达量无明显影响。见表5、图6。

表5 各组大鼠股骨骨组织中 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 蛋白量（±s）Tab.5 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX protein in femur of the rats(±s）

表5 各组大鼠股骨骨组织中 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 蛋白量（±s）Tab.5 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX protein in femur of the rats(±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。Note:Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，##P＜0.01.

组别 n Wnt10b β-catenin Runx2 OSX正常组模型组补佳乐组益骨汤组5 5 5 5 1.35±0.10 0.55±0.11**1.23±0.18##0.79±0.13 1.96±0.47 0.50±0.11**1.50±0.19##0.96±0.16 2.21±0.07 0.45±0.05**1.38±0.14##1.03±0.02##1.77±0.03 0.20±0.01**0.88±0.10##0.58±0.05##

图6 各组大鼠股骨骨组织中Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX蛋白相对表达量Fig.6 The relative expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX protein in femur of the rats

3 讨论

目前临床上治疗OP最常用的是激素替代疗法，但激素替代疗法副作用较多，包括睡眠障碍、情绪抑郁和头痛，此外还可导致子宫内膜增生，乳腺癌和卵巢癌的发病率增加[18-19]。补佳乐作为现在临床较为常用的一种外源性雌激素，主要成分为戊酸雌二醇，与人体卵巢自身分泌的雌激素类似，能够替代内源性雌激素的生理、生化作用，但仍然存在乳胀、情绪抑郁等副作用[20]，因而限制了其临床应用。

OP 属于中医“骨萎”“骨枯”“骨痹”的范畴，“肾主骨，生髓”，其发病机制与肾密切相关，其次与脾胃肝等相关[21]。根据中医补肾活血的治疗原则，笔者团队研发了临床经验方益骨汤（骨碎补、淫羊藿、补骨脂、丹参、生地、山药），用于OP的防治。本方以骨碎补、淫羊藿、补骨脂为君，补髓生精、温阳暖肾，佐以生地、丹参、山药活血益气，功能为补肾益精、活血益气，符合中医药治疗OP的治则。现代药理学研究发现，骨碎补、淫羊藿、补骨脂等补肾中药中含有黄酮类物质，结构与己烯雌酚相似，具有雌性激素样作用[22]，能够促进成骨细胞分化和增殖[23-25]。笔者前期研究结果表明，益骨汤含药血清可以促进成骨细胞增殖、分化及矿化[26]，促进骨形成，提高骨强度及生物力学性能[27]，改善骨质疏松动物血瘀的病理状态[28]。本研究也发现，补佳乐、益骨汤均能提高去势大鼠BMD，且效果无统计学差异，表明益骨汤能较好地缓解因雌激素水平下降导致的骨质疏松。

近年来研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在骨代谢过程中具有重要意义，以Wnt/β-catenin信号通路为靶向的药物研究，也已取得了一定进展[29]。Stevens等[30]研究表明Wnt10b基因缺失的小鼠成骨细胞数量及活性显著下降，导致OP的发生。β-catenin缺乏促使间充质干细胞向软骨分化[31]。笔者前期研究证实益骨汤能增高Wnt/β-catenin信号通路中βcatenin基因的表达[14]，本研究则进一步深入研究益骨汤的作用机制。实时荧光定量PCR提示益骨汤组Wnt10b、β-catenin基因的表达量高于模型组，DKK1基因表达量则低于模型组，且差异有统计学意义；但Western blot和免疫组化结果均提示，益骨汤组中Wnt10b、β-catenin蛋白表达量与模型组比较无统计学差异。笔者推测在该通路反应过程中，Wnt、βcatenin基因转录产物与其他物质形成了复合物，故组织中检测不到蛋白表达量的差异，对于其是否存在蛋白磷酸化及量效关系则需要进一步的实验论证，这也是需要深入研究的地方。

在经典Wnt信号通路中，Wnt蛋白可与细胞表面特异性受体卷曲蛋白（Frizzled）受体和辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low density lipoprotein receptor associated protein antibody 5/6，LRP5/6）共受体结合，抑制糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）并促进 β-catenin 的累积，累积的β-catenin易位于细胞核中，与细胞核内转录因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）一起诱导Wnt信号通路靶基因的表达[32]。研究发现，Wnt发生作用需要与受体LRP5/6结合，而DKK1能与LRP5/6、跨膜受体Kremen 1/2形成三聚体，诱导细胞内吞，减少LRP5/6在细胞膜上的表达，以此阻断Wnt信号向胞内传递[32]。因此笔者推测在该通路反应过程中，益骨汤可抑制DKK1基因的过表达，促使Wnt与LRP5/6形成复合物，激活Wnt信号通路，而补佳乐可能是直接调控该通路蛋白的表达，两者作用机制的差异尚需进一步研究加以证实。

Runx和OSX是多条信号通路的共同下游基因，其中Runx是骨髓间充质干细胞和成骨细胞分化、骨发育的重要调节因子，参与成骨细胞分化过程[33]；OSX可作为 Runx2的下游基因启动成骨基因，发挥成骨作用[34]。本研究发现，益骨汤能促进Runx2、OSX蛋白的表达，表明益骨汤能通过调控Runx2、OSX蛋白表达从而调控成骨过程。但Runx2、OSX作为多条通路的共同下游位点，笔者推测益骨汤可能还通过其他信号通路发挥作用，如骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）信号通路。研究证实，Runx2也是BMP-2的靶基因，BMP-2通过转录因子Runx2和肌节同源盒蛋白2（muscle segment homeobox，Msx2）调节 OSX 的表达[34-35]。本研究仅研究了益骨汤对Wnt/β-catenin经典信号通路的影响，后续研究中将对其他相关的信号通路进行探讨。

综上所述，本实验研究发现，益骨汤通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞的增殖，从而增高BMP，这可能是益骨汤的作用机制之一。在后续研究中，将通过体外实验来进一步验证益骨汤的作用机制，并对其他相关的信号通路进行探讨，为益骨汤的临床推广应用提供实验依据及理论基础。

[1]Khosla S，Riggs B L.Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis[J].Endocrinol Metab Clin North Am，2005，34(4):1015-1030.

[2]Reginster J，Burlet N.Osteoporosis:A still increasing prevalence[J].Bone，2006，38(2):4-9.

[3]Wright N C，Looker A C，Saag K G，et al.The recent prevalence of osteoporosis and low bone mass in the United States based on bone mineral density at the femoral neck or lumbar spine[J].J Bone Miner Res，2014，29(11):2520-2526.

[4]Tuzun S，Eskiyurt N，Akarirmak U，et al.Incidence of hip fracture and prevalence of osteoporosis in Turkey:the FRACTURK study[J].Osteoporos Int，2012，23(3):949-955.

[5]Travis R C，Reeves G K，Green J，et al.Gene-environment interactions in 7610 women with breast cancer:prospective evidence from the Million Women Study[J].Lancet，2010，375(9732):2143-2151.

[6]Zanchetta M B，Diehl M，Buttazzoni M，et al.Assessment of bone microarchitecture in postmenopausal women on long-term bisphosphonate therapy with atypical fractures of the femur[J].J Bone Miner Res，2014，29(4):999-1004.

[7]Pinkerton J V，Thomas S.Use of SERMs for treatment in postmenopausal women[J].J Steroid Biochem Mol Biol，2014，142:142-154.

[8]Ponnapakkam T，Katikaneni R，Sakon J，et al.Treating osteoporosis by targeting parathyroid hormone to bone[J].Drug Discov Today，2014，19(3):204-208.

[9]Marie P J，Kassem M.Osteoblasts in osteoporosis:past，emerging，and future anabolic targets[J].Eur J Endocrinol，2011，165(1):1-10.

[10]Allen M R，Burr D B.Three years of alendronate treatment results in similar levels of vertebral microdamage as after one year of treatment[J].J Bone Miner Res，2007，22(11):1759-1765.

[11]姚新苗，唐晶，徐禄基，等.益骨口服液治疗原发性骨质疏松症60例[J].浙江中西医结合杂志，2009，19(3):164.YAO Xinmiao，TANG Jing，XU Luji，et al.Yigu oral liquid in the treatment of 60 cases of primary osteoporosis[J].Zhejiang Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，2009，19(3):164.

[12]姚新苗，朱胤晟，平佃辉，等.益骨口服液对去势大鼠骨质疏松症外周血清炎性因子的影响[J].中医正骨，2012，24(11):7-10.YAO Xinmiao，ZHU Yinsheng，PING Dianhui，et al.Effect of yigu oral liquid on osteoporosis peripheral serum inflammatory factors in ovariectomized rats[J].Journal ofTraditionalChinese Orthopedicsand Traumatology，2012，24(11):7-10.

[13]李桂锦，姚新苗.益骨口服液对去势大鼠骨质疏松症痛阈及骨密度的影响[J].浙江中医药大学学报，2014，38(8):1004-1006.LI Guijin，YAO Xinmiao.Effects of Yi Gu oral liquid on pain threshold and bone mineraldensity in ovariectomized rats with osteoporosis[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University，2014，38(8):1004-1006.

[14]何帮剑，朱胤晟，应建伟，等.益骨汤含药血清通过经典Wnt信号通路促进成骨细胞增殖分化的研究[J].新中医，2017，49(3):10-13.HE Bangjian，ZHU Yinsheng，YING Jianwei，et al.Yigu decoction serum containing drugs through the canonical Wnt signaling pathway promote osteoblast proliferation and differentiation[J].Journal of New Chinese Medicine，2017，49(3):10-13.

[15]姚新苗，黄绳武，施昕磊，等.益骨口服液的制备及临床应用[J].中国现代应用药学，2009，26(12):1034-1037.YAO Xinmiao，HUANG Shengwu，SHIXinlei，etal.Preparation and clinical application of Yi Gu oral liquid[J].Chin J Mod Appl Pharm，2009，26(12):1034-1037.

[16]Stomati M，Bernardi F，Luisi S，et al.Conjugated equine estrogens，estrone sulphate and estradiol valerate oral administration in ovariectomized rats:effects on central and peripheral allopregnanolone and beta-endorphin[J].Maturitas，2002，43(3):195-206.

[17]熊远珍.实验动物与人用药量的新换算[J].江西医学院学报，1997，39(4):41.XIONG Yuanzhen.New conversion of laboratory animal and human dose[J].Journal of Jiangxi Medical College，1997，39(4):41.

[18]Fournier A S，Berrino F，Riboli E，et al.Breast cancer risk in relation to different types of hormone replacement therapy in the E3N-EPIC cohort[J].Int J Cancer，2005，114(3):448-454.

[19]Beral V，Bull D，Green J，et al.Ovarian cancer and hormone replacementtherapy in the Million Women Study[J].Lancet，2007，369(9574):1703-1710.

[20]Tsai H W，Wang P H，Huang B S，et al.Low-dose addback therapy during postoperative GnRH agonist treatment[J].Taiwan J Obstet Gynecol，2016，55(1):55-59.

[21]马伟，牟慧琴，马占洋.绝经后骨质疏松症中医病因病机研究概况[J].中医杂志，2012，53(13):1152-1154.MA Wei，MOU Huiqin，MA Zhanyang.Overview of traditional Chinese Medicine pathogenesis of postmenopausal osteoporosis[J].Journal of Traditional Chinese Medicine，2012，53(13):1152-1154.

[22]朱丹，袁芳，孟坤，等.黄酮类化合物的研究进展[J].中华中医药杂志，2007，22(6):387-389.ZHU Dan，YUAN Fang，MENG Kun，et al.Research progress of flavonoids[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2007，22(6):387-389.

[23]宋渊，李盛华，何志军.骨碎补含药血清对成骨细胞增殖、成骨的影响[J].中国骨质疏松杂志，2014，20(2):125-128.SONG Yuan，LI Shenghua，HE Zhijun.Effect of Drynaria fortunei serum on osteoblast proliferation and osteogenesis[J].Chinese Journal of Osteoporosis，2014，20(2):125-128.

[24]Peng S，Xia R，Fang H，et al.Effect of epimedium-derived phytoestrogen on bone turnover and bone microarchitecture in OVX-induced osteoporotic rats[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2008，28(2):167-170.

[25]翟远坤，武祥龙，潘亚磊，等.补骨脂抗骨质疏松研究概况[J].中医杂志，2012，53(14):1244-1248.ZHAIYuankun，WU Xianglong，PAN Yalei，etal.Overview of anti-osteoporosis psoralen[J].Journal of Traditional Chinese Medicine，2012，53(14):1244-1248.

[26]姚新苗，冷涛，张云鹏.益骨口服液含药血清对成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2010，18(1):6-8.YAO Xinmiao，LENG Tao，ZHANG Yunpeng.Effect of serum containing Yigu Oral Liquid on proliferation，differentiation and mineralization of osteoblasts[J].Chinese Journal of Traumatology，2010，18(1):6-8.

[27]姚新苗，徐禄基，冷涛，等.益骨口服液对去势大鼠骨密度与骨生物力学的影响[J].浙江中医药大学学报，2010，34(2):142-143.YAO Xinmiao，XU Luji，LENG Tao，et al.Effects of Yi Gu OralLiquid on bone mineraldensity and bone biomechanics in ovariectomized rats[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University，2010，34(2):142-143.

[28]朱胤晟，姚新苗，吕一.益骨口服液对去势大鼠骨质疏松症血瘀病机微观分子的影响[J].江苏中医药，2013，45(5):71-72.ZHU Yinsheng，YAO Xinmiao，LYU Yi.Effects of Yi Gu Oral Liquid on microscopic molecules of osteoporosis in ovariectomized rats[J].Jiangsu Traditional Chinese Medicine，2013，45(5):71-72.

[29]楼超，陈鸿亮，徐华梓.Wnt/β-catenin信号通路及与之相关骨质疏松药物研究[J].中国骨质疏松杂志，2014，20(1):78-83.LOU Chao，CHEN Hongliang，XU Huazi.Studies on Wnt/β-catenin signaling pathway and related osteoporosis drugs[J].Chinese Journal of Osteoporosis，2014，20(1):78-83.

[30]Stevens J R，Miranda-Carboni G A，Singer M A，et al.Wnt10b deficiency results in age-dependent loss of bone mass and progressive reduction of mesenchymal progenitor cells[J].J Bone Miner Res，2010，25(10):2138-2147.

[31]Hill T P，Spter D，Taketo M M，et al.Canonical Wnt/β-catenin signaling prevents osteoblasts from differentiating into chondrocytes[J].Dev Cell，2005，8(5):727-738.

[32]Butler J S，Murray D W，Hurson C J，et al.The role of Dkk1 in bone mass regulation:correlating serum Dkk1 expression with bone mineral density[J].J Orthop Res，2011，29(3):414-418.

[33]Jeon E J，Lee K Y，Choi N S，et al.Bone morphogenetic protein-2 stimulates Runx2 acetylation[J].J Biol Chem，2006，281(24):16502-16511.

[34]Ulsamer A，Ortuo M J，Ruiz S，et al.BMP-2 induces osterix expression through up-regulation of Dlx5 and its phosphorylation by p38[J].J Biol Chem，2008，283(7):3816-3826.

[35]Urist M R.Bone morphogenetic protein:the molecularization of skeletal system development[J].J Bone Miner Res，1997，12(3):343-346.