肖艳红，周晓慧，徐 倩，王 冉，赵春颖

（承德医学院，河北承德 067000）

真菌多糖具有多种生理活性，如抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等[1-3]。从真菌中提取并筛选有活性的多糖一直是国内外众多领域研究和开发的热点。牛肝菌[4]俗称“大脚菇”，是一种稀有、名贵的野生食用真菌。根据文献报道，牛肝菌多糖的提取方法较多。王浩华等[5]发现，微波法比水提醇沉法和超声波法的提取率高，但工业生产上考虑绿色环保，不宜采用长时间、高强度的微波；李志洲[6]采用了泡沫分离法，但工艺中需要使用表面活性剂、消泡液等，增加了原料的消耗，且需要控制空气流速，操作难度较大；杜敏华等[7]采用传统的水提醇沉法，但并未全面考察各种因素对提取工艺的影响，多糖提取率较低。水提醇沉法为提取真菌多糖最经典的方法，具有工艺简单、成本低、易于推广等特点。为此，本研究使用了水提醇沉法，并采用正交试验法优化了牛肝菌多糖的提取工艺，以期为进一步地开发利用牛肝菌提供实验依据。

1 材料与仪器

牛肝菌，购于承德润隆食品有限公司（批号20120906003）。所用试剂均为分析纯。电热恒温水浴锅（WSZ-133-65，上海东星建材实验设备有限公司）；旋转蒸发器（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵（石家庄阳星仪器贸易有限公司）。

2 方法与结果

2.1 牛肝菌多糖的提取流程[8]称量牛肝菌粉末15.0g，加300ml石油醚于70℃水浴锅中脱脂1.5h后抽滤。脱脂后的牛肝菌以不同的料水比于100℃水浴锅中加热不同时间，4000r/min离心10min。取沉淀重复加水、加热、离心三个步骤，进行不同的次数。多次所得的上清液置于旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩比为5：1，向浓缩液中加入无水乙醇至不同的乙醇浓度。低温静置过夜后4000r/min离心10min，将上层酒精萃取液再次用旋转蒸发仪进行浓缩、醇沉，4000r/min离心10min。收集两次所得沉淀，即得牛肝菌多糖。牛肝菌多糖-40℃低温冷冻48h干燥，称量冻干膏，并计算多糖提取率。多糖提取率=（冻干膏质量/牛肝菌粉末质量）×100%。

2.2 牛肝菌多糖提取的单因素实验 选用料水比、提取时间、提取次数和醇沉浓度4个因素进行单因素实验，考察各因素变量对牛肝菌多糖提取率的影响，选出适宜的条件范围。

2.2.1 料水比：多糖提取率随料水比的增加逐渐增加，考虑浓缩过程的成本，初步确定料水比为1：20～1：30(g/ml)。见图1：

图1 料水比对多糖提取率的影响

2.2.2 提取时间：多糖提取率随提取时间的延长而增加，但提取时间过长会增加能源消耗，故初步确定提取时间为1.0～2.0h。见图2：

图2 提取时间对多糖提取率的影响

2.2.3 提取次数：随着提取次数的增加，多糖提取率逐渐上升。提取4次时最高峰值最高，因此确定提取2～4次进行正交实验。见图3：

图3 提取次数对多糖提取率的影响

2.2.4 醇沉浓度：多糖提取率随乙醇浓度的增大而增加，但乙醇浓度为85%时提取率下降，因此确定乙醇浓度为70%～80%。见图4：

图4 乙醇浓度对多糖提取率的影响

2.3 牛肝菌多糖提取的正交试验设计 在单因素实验结果的基础上，以多糖提取率和多糖含量为考察指标，对料水比、提取时间、提取次数和醇沉浓度4个因素进行L9(34）正交优化。因素水平见表1：

表1 正交试验因素水平表

2.4 牛肝菌多糖含量的测定 称量冻干膏并加水溶解，结合葡萄糖标准曲线计算冻干膏中牛肝菌多糖含量。葡萄糖标准曲线的制作采用苯酚-硫酸法[9]。多糖含量=（多糖质量/冻干膏质量）×100%。

正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。影响多糖提取效果的因素顺序为提取时间＞乙醇浓度＞料水比＞提取次数，其中提取时间对多糖提取效果的影响最显著。确定最佳提取工艺为：A1B1C2D3，即料水比为1：20(g/ml)，提取2次，每次1.5h，乙醇浓度为80%。

表2 牛肝菌多糖提取正交试验结果

表3 方差分析表

2.5 最佳提取工艺验证 称取牛肝菌粉末15.0g，共3份，分别按照最佳提取工艺进行平行验证试验。牛肝菌中多糖平均提取率为29.56%，干膏中多糖的平均含量为53.83%，菌体中多糖的平均含量为15.91%。表明本文中的最佳提取工艺合理，稳定可行，能有效提取牛肝菌中的多糖。结果见表4：

表4 优选工艺的验证试验

3 讨论

本研究在实验过程中发现，提取时间和次数达到最大时多糖已提取完全，继续提取只会增加干膏中多糖以外其它成分的含量，因此随着提取时间的延长和提取次数的增加，干膏中多糖含量与多糖提取率并不成正比。本研究通过正交试验，以多糖提取率和干膏中多糖含量为评价指标，筛选出了牛肝菌多糖的最佳提取工艺，即料水比1：20(g/ml)、提取2次、每次1.5h、醇沉时乙醇浓度为80%。此时牛肝菌多糖提取率为29.56%，干膏中多糖含量高达53.83%，菌体中多糖含量为15.91%。

【参考文献】

[1]Jia J, Zhang X, Hu YS, et al. Evaluation of in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum polysaccharides in STZ-diabetic rats [J]. Food chemistry, 2009, 115(1): 32-36.

[2]Meng F, Liu X, Jia L. Optimization for the production of exopolysaccharides from Morchella esculenta SO-02 in submerged culture and its antioxidant activities in vitro [J].Carbohydrate Polymers, 2010, 79(3):700-704.

[3]盛伟，方晓阳，吴萍.白灵菇、杏鲍菇、阿魏菇多糖体外抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2008，29(5)：103-106.

[4]崔福顺，张华，李官浩，等.美味牛肝菌黄酮类提取物体内抗氧化作用研究[J].食品科技，2014，39(8)：201-205.

[5]王浩华，谢美华，宋信信.云南野生粗网柄牛肝菌粗多糖提取工艺及抗氧化能力的研究[J].楚雄师范学院学报，2015，30(9)：44-47.

[6]李志洲.泡沫分离法优化美味牛肝菌多糖分离工艺[J].食品与机械，2012，28(3)：130-134.

[7]杜敏华，张英君，刘明星，等.野生牛肝菌多糖提取工艺的优化及其对自由基的清除作用[J].食品工业科技，2012，33(22)：292-295.

[8]熊伟，陈芝兰，钟国辉，等.西藏野生变色疣柄牛肝菌粗多糖提取及单糖组成研究[J].应用化工，2007，36(6)：554-556.

[9]涂宗财，李敏，刘光宪，等.苯酚-硫酸法测定油菜花粉多糖含量的研究[J].食品工业科技，2007，28(4)：219-221.