陈丽莉，韩晨珠，王艳心，王 成，李保强△

（1.承德医学院附属医院，河北承德 067000；2.漯河市第二人民医院皮肤科）

结节性红斑(erythema nodosum，EN)是一种常见的炎症性脂膜炎，以红斑、炎症性皮下结节为主要表现，该病病因复杂，确切的发病机制仍不清楚，病理变化主要以淋巴细胞浸润为主。目前国内外多项研究表明，T淋巴细胞亚群分布异常与EN发病有关，而CD4+T淋巴细胞数量及功能失衡是T淋巴细胞免疫功能异常的重要表现[1-3]。本研究拟检测EN患者皮损处CD4、CD8表达的变化，进一步探讨EN的发病机理。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集承德医学院附属医院皮肤科1984年9月-2014年6月经临床及病理确诊，并存档的原发性EN患者皮损组织和正常皮肤组织蜡块。疾病组49例患者中男4例、女45例，年龄6岁～60岁，平均（37.18±12.26）岁；正常组中10例正常皮肤组织，男3例、女7例，年龄20岁～65岁，平均（43.00±14.51）岁。

1.2 试剂来源 兔抗人CD4单克隆抗体（RMA-0620）、鼠抗人CD8单克隆抗体（MAB-0021）、即用型快捷型免疫组化MaxVisionTM试剂盒、羊抗鼠/兔（KIT-5010）二抗、DAB显色试剂盒（DAB-0031），福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 免疫组化染色及结果判定

1.3.1 染色方法：采用MaxVisionTM免疫组织化学染色法检测CD4和CD8的表达。组织置于4%甲醛中固定后常规石蜡包埋，切片厚度4μm；切片于80℃电热恒温箱烘烤3h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3%H2O2室温孵育，抗原修复，一抗（工作浓度1：50）4℃过夜，二抗室温孵育2小时，DAB显色，苏木素复染；1%盐酸酒精分化，氨水返蓝后封片。光镜下观片，双盲法计数阳性细胞。CD4和CD8阳性着色为棕黄色颗粒，位于淋巴细胞的细胞膜、细胞浆。以PBS代替一抗作为空白对照，以已知阳性结果的组织切片作为阳性对照。

1.3.2 结果判断：根据Fromowitz[4]的综合计分法进行。在高倍镜下（10×40）作如下评分：⑴阳性程度：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；⑵阳性细胞百分率：5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞76%为4分。⑴+⑵判定最终结果：＜2分为阴性（-），2分～3分为弱阳性（+），4分～5分为中度阳性（++），6分～7分为强阳性（+++），以+及以上计为阳性。

1.3 统计分析 实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析，率的比较用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

疾病组CD4阳性率为100.00%，明显高于对照组的70.00%，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。疾病组、对照组CD8阳性率分别为93.88%和90.00%，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1-4，附表：

附表 疾病组皮损处和正常组皮肤组织CD4和CD8的表达情况

图1 EN皮损组织CD4染色（×400）

图2 正常皮肤组织CD4染色（×400）

图3 EN皮损组织CD8染色（×400）

图4 正常皮肤组织CD8染色（×400）

3 讨论

根据细胞表面白细胞分化抗原决定簇的表达情况可将T细胞分为两个亚群，即表达CD4的辅助T细胞(Th)和表达CD8的细胞毒性T细胞(CTL)，二者通常被作为判断和确定T淋巴细胞亚群及成熟的标志。CD4分子为单链跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族(IgSF)成员，主要分布于T淋巴细胞，也分布于单核-巨噬细胞、胸腺细胞、B细胞的表面；CD8分子为二聚体结构，其双链结构也属于IgSF成员[3]。CD4+T细胞识别由MHC-Ⅱ类分子提呈的外源性抗原肽，作用是通过激活巨噬细胞产生和分泌多种细胞因子，引起以T淋巴细胞和单核-巨噬细胞浸润为主的局部渗出性炎症和免疫反应[5]。在炎症反应中，活化的CD4+T细胞通过过度表达共刺激分子（CD40L）与单核细胞、内皮细胞、B细胞上的相应配体结合，从而诱导B细胞增殖、抗体形成及免疫球蛋白的分泌。CD8+T细胞通过识别由MH C-Ⅰ类分子提呈的内源性抗原肽发挥效应，主要是在某些细胞因子诱导下识别靶细胞，进而杀伤靶细胞，诱发免疫损伤，同时抑制体液免疫[6-7]。正常情况下，CD4+、CD8+T细胞数量或比值维持动态平衡，以保持机体正常的生理功能[3]。

有研究表明，T淋巴细胞亚群分布异常与多种血管炎性疾病的发生密切相关，而CD4+T细胞数量及功能失衡是导致T淋巴细胞免疫功能异常的重要因素[3]。EN做为一种以脂肪小叶间隔为主的脂膜炎，主要由Ⅳ型变态反应介导，55%以上为原发性，但也可以是系统疾病的皮肤表现，如系统性红斑狼疮、麻风、炎性肠病、结节病及肿瘤等[8]。Behcet’s病是一种自身免疫性疾病，可累及多个系统，而结节性红斑也是此病的常见体征。Wang等[9-10]研究发现，Behcet’s病患者结节性红斑皮损处有大量的T淋巴细胞浸润，以CD4+T细胞浸润为主；并且发现，Behcet’s病结节性红斑中共刺激分子的大量表达促进了CD4+T细胞的活化、增生，从而导致了炎症的发生和持续。本研究所有病例的结节性红斑均为原发表现，且结果与上述研究发现类似，EN皮损处和正常皮肤组织均可见CD4和CD8的阳性表达，但疾病组CD4阳性表达率明显高于正常组，说明EN皮损处也存在着以CD4+T淋巴细胞浸润为主的免疫损伤；但疾病组和正常对照组CD8阳性表达率比较差异无统计学意义，考虑EN皮损的免疫损伤不以CD8+T淋巴细胞浸润为主。

综上所述，本研究显示在EN患者皮损处存在着T淋巴细胞亚群的失衡，主要是与CD4+T细胞介导的免疫损伤有关，因此考虑CD4+T细胞在EN皮损的发病过程中起了重要作用。

【参考文献】

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[4]Fromowitz FB,Viola MV,Chao S,et al.Ras p21 expression in the progression of breast cancer [J].Hum Pathol,1987,18(12):1268-1275.

[5]Crispin JC, Liossis SN, Kis-Toth K, et al. Pathogenesis of human systemic lupus erythematosus: recent advances[J].Trends Mol Med,2010,16(2):47-57.

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[7]McCarthy MK, Weinberg JB. The immunoproteasome and viral infection: a complex regulator of in fl ammation[J].Front Microbiol,2015,6:21.

[8]Schwartz RA, Nervi SJ.Erythema nodosum: a sign of systemic disease[J].Am Fam Physician,2007, 75(5): 695-700.

[9]王红，杨培增，彭晓燕，等.共刺激分子在Behcet病患者结节红斑组织中的表达[J].首都医科大学学报，2005，26(3)：258-262.

[10]Wang H, Yang PZ, Peng XY, et al. An increased expression of CD40/CD40L costimulatory molecules in erythema nodosum of patients with Beh(c)et’s disease[J].Int J Ophthalmol,2007,7(4):883-886.