高 燕，钟素飞，奉树成

(上海植物园 上海城市植物资源开发应用工程技术研究中心，上海 200231)

微型月季(RosachinensisMinima或Rosaroelletti)为蔷薇科多年生木本植物，株型矮小，整体植株不超过30 cm[1]。叶片和花朵娇小，花朵直径3 cm左右，色彩绚丽，单朵花期10 d左右，整株花期可达1个月，适应性强，一年内多次花芽分化，是一种优良的园林绿化和盆栽材料[2]。微型月季因小巧玲珑、花量大、不间断开花、花色绚烂等原因备受人们喜爱。但因株型矮小、节数少，加之受种苗数量、季节等诸多因素的制约[3]，常规扦插和嫁接繁殖方法的繁殖系数低、繁殖速度慢、成本高[4]。为此，特开展微型月季组织培养体系研究，以提高育苗产量，降低成本。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2016—2017年在上海植物园进行。材料取自上海植物园蔷薇园。2016年3月初，取微型月季茎尖部位作为外植体，进行组织培养。

主要试剂包括75%乙醇、0.1% HgCl2、体积分数0.5%的吐温20。纯净水、装有50 mL纯净水的100 mL三角瓶、镊子、托盘、滤纸，121 ℃灭菌18 min备用。

1.2 方法

取微型月季茎段上部较柔软部分1～2 cm(带腋芽)，去除叶片，在加洗洁精的水中清洗20 min，再用流水冲洗1 min。在超净工作台中，将冲洗干净的微型月季茎尖投入装有50 mL纯净水的100 mL三角瓶中清洗1次，然后用75%乙醇振荡清洗30 s、无菌水冲洗2次，再用0.1% HgCl2+体积分数0.5%的吐温20消毒，最后无菌水冲洗5次，滤纸吸干茎段表面水分。

以下培养基配置中如无特殊说明，均须添加蔗糖30 g·L-1、琼脂7.8 g·L-1，并调节pH值至5.8。

1.3 处理设计

1.3.1 灭菌

按1.2节方法操作至加入HgCl2和吐温20，分别灭菌3、6、9 min，用无菌水冲洗外植体5次以尽量减少HgCl2对外植体的伤害。然后，用无菌滤纸吸干外植体表面水分待用。比较不同灭菌时间下微型月季茎尖的污染率和出芽率。

1.3.2 诱导培养

以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA，以诱导微型月季茎尖出芽。6-BA浓度分别设定为0、1、2 mg·L-1，NAA浓度分别设定为0、0.1、0.2 mg·L-1。

1.3.3 增殖培养

增殖过程是促进微型月季细胞不断分裂、分化，形成大量芽的过程。以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA，对诱导培养基上诱导出的芽进行增殖培养，观察微型月季发育情况，确定最佳增殖培养基。6-BA浓度分别设定为0、1、2 mg·L-1，NAA浓度分别设定为0、0.06、0.12 mg·L-1。

1.3.4 生根培养

英国史上最糟糕的麦克风政治风波发生在1993年，主角是时任首相梅杰。他骂内阁部分成员是“野种”，声称他们会被“钉死在十字架上”。事后，他遭到了国内严厉的指责。

以1/2 MS为基本培养基，对比添加0.3 mg·L-1IBA和不添加IBA条件下微型月季的生根情况。

1.4 炼苗和移栽

获得带根的健康微型月季组培苗后，将苗移植入大棚。选择最适合的基质和最佳生长条件，以保证微型月季正常生长。

2 结果与分析

2.1 灭菌

灭菌3 min，污染率为93.3%，基本整个茎尖受到污染；灭菌6 min，污染率降低到13.3%，继续培养20 d，出芽率可达73.3%，长出的新芽发育状况良好；灭菌9 min，污染率仅为6.7%，但继续培养20 d，出芽率降至20.0%。综上，以灭菌6 min较适宜。

2.2 诱导培养

由表1可以看出，不添加6-BA，NAA浓度分别为时0、0.1、0.2 mg·L-1时，基本无法诱导出芽或者诱导率很低。当6-BA为1 mg·L-1、NAA为0.1、0.2 mg·L-1时，诱导率分别为83.3%和73.3%，诱导22 d左右可出芽，芽生长速度快，发育正常。当6-BA为2 mg·L-1、NAA为0.2 mg·L-1时，诱导率为60.1%，但诱导出的芽培养一段时间后，有玻璃化倾向，特别是芽基部畸形，个别出现芽连在一起且透明化的情况。综上，MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1适合微型月季诱导出芽，经过22 d培养，83.3%的茎段可诱导出芽，新芽生长速度快，发育正常，生长健康。

2.3 增殖培养

幼苗生长至1.5 cm左右时，从基部切下，转至增殖培养基中。由表2可知，MS培养基中不添加6-BA时，其伸长和增殖速度缓慢。添加1 mg·L-16-BA+0.06 mg·L-1NAA时，芽的生长速度明显加快，伸长倍率达到3.84，增殖倍率为4.20，植株健康，芽生长迅速、粗壮，增殖速度快。添加1 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA时，伸长倍率为3.51，对应的增殖倍率为3.93，芽生长迅速，少数有畸形，个别有生根。当6-BA为2 mg·L-1时，生长速度较快，但是苗不粗壮，并随着NAA浓度的升高，逐渐出现玻璃化现象。由此可知，最佳增殖培养基为MS+1 mg·L-16-BA+0.06 mg·L-1NAA，此时芽生长迅速且健康，节间短，增殖速度快。

表1 6-BA和NAA浓度对微型月季诱导出芽的影响

表2 继代1个月时不同激素含量对微型月季 增殖的影响

2.4 生根培养

丛生芽长到3～4 cm时，转至生根培养基。从表3可以看出：不添加激素，仅用基本培养基1/2MS情况下，平均生根数为3.69，平均根长为4.12 cm，此时植株伸长系数为1.46倍，生根率为86%。在基本培养基1/2 MS中添加IBA 0.3 mg·L-1，生根数有了很大提升，接近无激素培养基的2倍，达7.24，平均根长略短于无激素培养基，为3.79 cm，茎段伸长倍率为1.98，生根率为98%。由此可知，1/2 MS+IBA 0.3 mg·L-1是更适宜的生根培养基。

表3 继代1个月时不同培养基对微型月季增殖和 生根的影响

图1 生根2个月后根的生长情况

2.5 炼苗和移栽

在生根培养基上生长1个月后，植株健康且健壮，待植株生长至4 cm左右、有大量健康根时，可以炼苗、移栽。在培养间揭去瓶盖放置3 d后，用清水冲洗根，除掉黏附其上的培养基，略微整理并种植于内置珍珠岩的穴盘中，穴盘规格45 cm×45 cm，每个穴盘种植150株左右。2个月后观察，主根发育明显，生长健壮，成活率可达98%。每个月喷洒2次0.1%多菌灵。经过2个多月，由于珍珠岩无法保存营养成分，且受密植条件限制，须将健康植株转至新的营养钵中。营养钵内基质为草炭∶珍珠岩3∶1(体积比)，移栽20 d后每月施1/1 000氮磷钾肥(图2)。

图2 炼苗移栽后微型月季开花

3 小结与讨论

组织培养是利用植物细胞全能性原理实施的技术[5]。从原理上来说，植物的每个细胞都可以发育成一个独立的个体，但由于现有技术的局限性，目前还不能完全实现。实际操作中，一般会选择植物分生能力较强的部位作为外植体进行培养，例如茎尖、腋芽、根尖等，细胞的分裂和分化能力直接决定了组织培养中细胞的繁殖速度和繁殖效率。本试验中选取微型月季茎段带腋芽的幼嫩部位，即选取分生能力较强的部位作为外植体进行试验，有利于后期培养过程中的快速繁殖。

组织培养要在完全无菌条件下进行。要获得完全无菌的接种材料，一方面可以选取植物组织内部无菌的材料，另一方面，可以通过消毒处理杀死植物材料表面存在的各种微生物。一般多根据试验材料选用合适的消毒剂及适合的浓度和处理时间，以及合适的消毒方法[6]。常规试验中经常使用5%～10%漂白粉、70%～75%酒精、0.1%～0.2%升汞，及2%～10%次氯酸钠等灭菌液脱毒[7]。本试验采用添加了体积分数0.5%吐温20的0.1%升汞溶液作为灭菌溶液，灭菌6 min，随后用无菌水多次冲洗，以减少升汞对外植体的毒害。吐温主要起到增加渗透性、提高灭菌效率的作用。在此条件下，污染率降至13.3%。20 d后出芽率可达73.3%，且新出芽体健康，色泽翠绿，生长迅速。

生长素和细胞分裂素在组织培养中是常用的激素。激素的正确配比可以促进外植体的生长，在组织培养过程中具有决定性作用。生长素和细胞分裂素不一定适用于组织培养的每个步骤，其使用情况取决于植物各阶段发育情况。本试验中，诱导和增殖步骤均使用生长素NAA和细胞分裂素6-BA，而生根过程采用的是生长素IBA。采用6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1是比较适合微型月季诱导的配比，在此配比下，经过22 d的生长，茎段诱导率可达83.3%，芽生长情况较好。增殖过程中最佳的激素方案为MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.06 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂7.8 g·L-1，此时伸长倍率3.84，对应增殖倍率4.20，植株健康，茎段粗壮，节间短，生长旺盛。在快速增殖过程中，除了基部分化不定芽外，伸长的每个节间也可以切断用于增殖，繁殖速度大大提高。过高的生长素或分裂素会引起植株的玻璃化。植物组织玻璃化，即植物结构发育畸形，是一种生理失调或生理病变，很难继续用于继代培养和扩繁材料[8]。IBA是人工合成生长素，在促进生根过程中起重要作用。本试验中，添加IBA与无激素添加培养基生根效果差异明显，添加IBA的培养基生根量接近无激素培养基的2倍，生根率也从原来的86%提高到98%。

植株在生根培养基上促进根生长，但是过长的根会导致其缠绕，增加炼苗难度，且过长的根在转移到基质后会腐烂。因此培养1个月，根长至3～5 cm即可取出炼苗。为了逐渐适应外界环境，首先在培养室下开盖3 d，适应外部环境后，取出幼苗并用流水冲洗去除培养基，用于炼苗。培养基彻底清除才能防止苗发霉长菌，但不是去除培养基即可保证后期不会发霉长菌，因此在炼苗后须定期喷洒多菌灵溶液，同时须保证通风良好。炼苗最初采用珍珠岩固定根部，大孔隙可以保持根部生长环境良好，但珍珠岩保水性较差，因此需要每天浇水。随后生长2个月，根得到了足够生长，主根明显，此时需要宽松、保水和提供养分的基质，因此将植株转移到草炭∶珍珠岩3∶1(体积比)基质中，并定期施加薄肥。大的营养钵可以提供足够的土壤空间和肥力，有利于植物的正常发育。

[1] 蒲建霞. 微型月季组培快繁技术[J]. 北方园艺, 2006(4):156.

[2] 牟会斌. 微型月季微繁体系的构建及组培生根机理研究[D]. 南京：南京农业大学, 2001.

[3] 张作梅. 微型月季组培快繁技术体系的研究[D]. 合肥：安徽农业大学, 2009.

[4] 刘慧. 微型月季茎段组培快繁技术研究[J]. 北方园艺, 2011(14):114-116.

[5] 高燕, 宋垚, 叶康,等. 矾根欧布西迪昂组培快繁技术[J]. 浙江农业科学, 2015 (6):895-898.

[6] 高燕, 魏宇昆, 奉树成. 贵州鼠尾草组织培养育苗技术[J]. 浙江农业科学, 2017, 58(3):407-411.

[7] 杨海莲, 孙晓潞, 宋未. 植物内生细菌的研究[J]. 微生物学通报, 1998, 25(4):224-227.

[8] 胡彦, 赵艳. 植物组织培养技术的应用以及在培养过程中存在的问题[J]. 陕西师范大学学报(自然科学版), 2004，32(专辑):130-134.