毕菲菲 郝振凯 孙 霈 于咏兰 索 勋 刘贤勇

(中国农业大学动物医学院,北京 100193)

鸡球虫病是由艾美耳属一种或多种球虫寄生于鸡肠上皮细胞内所引起的原虫病(汪明,2003)。该病对养鸡业危害极大,其发病率达80%～100%,病死率达20%～30%,严重时病死率高达80%(刘贤勇等，2004)。

目前世界公认的鸡球虫种类有7种,分别是柔嫩艾美耳球虫Eimeriatenella、毒害艾美耳球虫E.nectrix、和缓艾美耳球虫E.mitis、堆型艾美耳球虫E.acervulina、早熟艾美耳球虫E.precox、布氏艾美耳球虫E.brunetti和巨型艾美耳球虫E.maxima，其中危害最为严重的是毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫(索勋等，1998)。Levine(1939)首次发现磺胺类药物可以治疗鸡球虫病,Grumbles(1948)用磺胺喹噁啉预防鸡球虫病后,化学药物被用于防治鸡球虫病,并逐渐成为控制鸡球虫病的主要手段。目前仍应用生产的抗球虫药有20余种,按其化学结构和生产过程大致可分为中草药、化学合成类、抗生素类抗球虫药(李佩国等，2006)。

1 中草药

我国是中草药资源最丰富的国家,有关中草药驱杀寄生虫的功能,早在我国古代的医学论著中就有记载(史福盛,1997)。中草药具有抑杀球虫,使用安全,毒副作用小,且能增强机体免疫功能及促进雏鸡生长,不易产生耐药性等优点,已得到越来越多研究学者的青睐(陈雷等，2013)。

1.1 防治鸡球虫病的中草药种类

防治鸡球虫病的中草药大致分为5大类(胡元亮，2006):(1) 驱虫类:这类药物能够直接杀死球虫或抑制球虫生长发育,是防治鸡球虫病的常用药。常见的有常山、仙鹤草、使君子、冰片、鸦胆子、百部、雄黄等药物, 其中最常见的药物是常山。(2)清热燥湿类:常见药物有苦参、黄芩、黄柏、黄连、秦皮、白头翁等。(3)清热解毒类:一类具有解毒、利湿、清热的药物。常见的有青蒿、白茅根、马齿苋、柴胡、穿心莲、地锦草、蒲公英等。(4)补益气血类:提高机体抵抗力,增强机体杀虫、驱虫作用的一类药物。如当归、党参、甘草、黄芪、熟地等。(5)活血止血类:用以对症治疗球虫病的出血的一类药物。如丹参、桃仁、地榆炭、仙鹤草、白芨等。上述中药方剂之间按照一定的组方法则进行配伍,以达到最佳组合效应,从而取得最好的防治鸡球虫病的效果(周作勇等，2005)。

1.2 中草药单方、复方及其药效

目前用来防治鸡球虫病的中草药单方主要有青蒿、常山、白头翁、苦参等。常山又名卤喹酮,它的主要成分为常山酮,常山酮原粉能够用于多种球虫的防治；钩藤含有钩藤碱,对球虫裂殖子有抑杀作用；蛹虫草这种食物菌菌糠用来饲喂肉鸡、蛋鸡,可提高产量,改善品质。中草药防治鸡球虫病仍以复方制剂的研制与应用为主，不同中药的组方及不同剂型经过科学组方、合理搭配,使各药物相互协调,产生全方位的协调作用和对机体有利因子的整体调动,从而达到抗虫,治病的目的。

表1 中草药单方、复方防治鸡球虫病的疗效Tab.1 Efficacy of Single-herb, multi-herb prescription for prevention and treatment of chicken coccidiosis

续表1Tab.lContinued

试验材料Experiment material评价指标Criteria药名Drug(s)虫株,攻虫剂量Species, Dosage剂量, 给药方式,用药时间Dosage, Administration, Days存活率Survival rate(%)相对增重率Relative weight gain rateACI参考文献References- E.T8.0×10415 %、拌料(Mixing)0-8100(100)102.6(104.4)188.3(186.7)郑明学等,2001- E.T8.0×1041%、拌料(Mixing)(-2)-7100(100)101.8(96.2)179.8(174.2)颜 卉等,2005- E.MA1×1051.0 g/mL、饮水(Drinking)(-2)-890(80)84.9(46.6)161.9(80.2)林青等,2011- E.T5.0×10460 g/kg、拌料(Mixing)(-2)-8100(100)68.9(74.9)157.9(166.4)王天奇等,2004球克星 QiukexingE.T5.0×1042 g/kg、拌料(Mixing)(-2)-8100(98)94.5(78.0)171.2(142.7)刘诗柱等,2011- E.T5.0×1051 ml、饮水(Drinking)0-8100(100)29.4(68.5)120.1(156.8)康 明等,2009常青克球灵KeqiulingE.T8.0×1042%、拌料(Mixing)0-7100(73.3)92.3(59.0)186.3(73.8)刘秀玲,2014- E.T8.0×1040.5 %、拌料(Mixing)0-5100(100)89.5(90.2)167.5(175.2)周翠珍,2007- E.T1.0×1052%、拌料(Mixing)(-2)-775(83.3)85.0(64.0)146.0(128.3)陈雷等,2013- E.T5.0×1040.1%、拌料(Mixing)0-7100(100)101.9(99.9)191.9(196.9)杨静静等,2015- MIX1×10510 g/L、饮水(Drinking)0-785(95)87.5(91.4)165.7(181.7)郭永刚等,2014

注:(),各实验组对照药物的参数值; -,未命名。

Note: (), The parameter values of the control drugs in each experimental group.-, Unnamed.

通过人工感染艾美耳球虫孢子化卵囊, 以存活率、相对增重率、平均病变值、卵囊值、抗球虫指数进行判定,结果证明不同中草药的不同配比可明显改善鸡的增重率和存活率,减少卵囊排出量,提高饲料利用率,有显著的抗球虫作用,其效果甚至优于一部分化学药物。

1.3 中草药防治鸡球虫病作用机理

对于中草药作用机理的研究,目前认为中草药能够防治鸡球虫病主要体现在以下3个方面: (1)抑制球虫的发育:中草药抗球虫主要是通过杀死球虫或抑制球虫发育来发挥作用的。张文香等(2005)通过研究中草药复方处理后球虫卵囊的孢子化率,发现所用中草药对球虫卵囊的孢子化率有明显的抑制作用。(2)增强动物机体的免疫功能:一些中草药能显著提高机体的非特异性和特异性免疫力,以增强机体的抗病力。葛凯等(2009)通过自制的中草药复方制剂，研究其对球虫感染鸡的血液成分影响,结果发现中药方剂能显著提高鸡体血清中的IgG、IgM、IgA含量，维持血糖稳定在正常水平，并能明显提高溶菌酶等指标的水平。樊福好等(2000)研究发现黄芪多糖可提高球虫感染鸡的淋巴细胞玫瑰花环形成率、球虫感染鸡的刺激指数(LT率),并提高健康鸡的 C3b受体花球形成率。(3)缓解症状:部分中草药能够缓解球虫感染鸡的临床症状,如柴胡、白头翁等药物的解热作用；马齿苋、苦参等药物的止痢作用；地榆炭、仙鹤草等药物的止血作用等。

由于中草药抗球虫制剂中的成分复杂,对复方制剂作用机理的研究,仅从中兽医理论、组方法则和治疗效果的观察上来推理还不完善,还需结合现代医学研究的方法来检测相关指标。

2 化学合成药物

第一个作为连续(预防)给药的抗球虫化学合成药物是磺胺喹噁啉(Grumblesetal.,1948)。目前,化学合成的抗球虫药物种类很多,不同种类的药物效果上存在一定的差异(表2)。

3 聚醚类离子载体抗生素

从上个世纪50年代起,聚醚类离子载体抗生素就被用于鸡球虫病的防治。聚醚类抗生素类药物主要作用在球虫的细胞膜上,使水分子以及一些阳离子通过细胞膜进入球虫细胞内,破坏细胞膜的内外平衡,最终导致球虫因为过度的肿胀而死亡,从而达到防治疾病的目的。聂奎等(1995)通过对海赛克斯雏鸡人工接种感染E.tenella孢子化卵囊1×105，用鸡球素5 mg拌饲预防,使用存活率、病变值、卵囊值、相对增重率、抗球虫指数(ACI)评估鸡球素的疗效，结果发现其ACI值为172.2，而对照药物氯苯胍的ACI为28.2。聂奎等(2000)将罗曼公雏经口人工接种感染E.tenella孢子化卵囊1×105，通过存活率、相对增重率、盲肠病变计分、血便记分和抗球虫指数对4种药物进行药物疗效判定，结果发现球安、球佳为高效抗球虫药，其抗球虫指数为189.375和180.75，而加福和球净抗球虫指数仅为99.25和105.75。刘小艳等(2010)对经口人工感染1.0×105个/只E.tenella孢子化卵囊的雏鸡按100 kg饮水中分别添加100 g/L 尼卡巴嗪混悬液25、50、100 mL的剂量混饮连续给药5 d,其抗球虫指数分别为189.7、189.9、184.2,属高效抗球虫药。

表2 化学合成药物防治鸡球虫病的疗效Tab.2 Efficacy of chemical synthetic drugs for prevention and treatment of chicken coccidiosis

4 鸡球虫抗药性研究

4.1 抗药性的定义

抗药性一般被认为是药物控制寄生虫的失败,但抗药性的正式定义是对药物敏感性的转变。世界卫生组织(1965)将抗药性定义为:“在现场情况下,某一寄生虫虫株在使同种寄生虫毁灭和抑制其繁殖的药物浓度下仍能繁殖和生存的能力。这种对药物的抵抗力可能是相对的或完全的”。

4.2 抗药性的调查研究

为了解我国鸡球虫抗药性的发生和流行情况,为养鸡生产中正确选择高效抗球虫药、制订合理用药方案提供科学依据,并为现场监测球虫抗药性提供切实可行的判定方法和标准,国内学者对不同地区艾美耳球虫对不同药物的抗药性进行了调查研究(表3)。

目前报道的已产生抗药性的药物种类有地克珠利、马杜霉素、盐霉素、拉沙里菌素、莫能霉素、氯羟吡啶、氯苯胍、氨丙啉、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、常山酮、磺胺氯吡嗪钠、磺胺喹噁啉钠、球痢灵、托曲珠利、球佳、杜球、欲可胖、球安、海南霉素等20多种抗球虫药物。在检测艾美耳球虫对不同药物的抗药性中83.0%虫株(44/53)对地克珠利、92.5%虫株(37/40)对马杜霉素、92.3%虫株(24/26)对盐霉素、75.0%虫株(3/4)对拉沙里菌素、50.0%虫株(7/14)对莫能霉素、90.9%虫株(10/11)对氯羟吡啶、94.1%虫株(16/17)对氯苯胍、62.5%虫株(10/16)对氨丙啉、20.0%虫株(1/5)对癸氧喹酯、76.2%虫株(16/21)对尼卡巴嗪、100%虫株(2/2)对常山酮、82.3%虫株(14/17)对托曲珠利、93.3%虫株(14/15)对磺胺氯吡嗪钠、100%虫株(14/14)对磺胺喹噁啉钠、80.0%虫株(4/5)对球痢灵具有抗药性。

从国内学者对不同地区不同虫株的抗药性调查结果来看,球虫抗药性的问题在我国确实是一个非常严重的问题,对我国养禽业构成了极大的威胁,应加强球虫抗药性研究和检测工作,克服用药的盲目性。在科学原则的指导下,适时轮换用药或穿梭用药,防止抗药虫株的出现。

4.3 抗药机制研究

有鉴于艾美耳球虫抗药性的普遍性,许多球虫病研究学者进行了各种尝试来解析球虫抗药性的机制。球虫学研究领域的权威科学家Chapman(1984)博士认为抗药性是对存在于球虫群体中突变体定向选择的结果。找出与抗药性产生相关的基因,发现与抗药性相关的蛋白差异表达,对新药的研发以及抗药性分子检测方法的建立具有重要的意义。国内学者对此进行了大量的研究,获得了许多重要的信息。对于地克珠利抗药性机制的研究，姜连连等(2005)利用双向电泳技术,对柔嫩艾美耳球虫地克株利抗药株与敏感株的蛋白质表达图谱进行差异比较和分析,发现两者之间差异有5个蛋白质斑点,其中2个蛋白质分别为球虫子孢子表面抗原TA4和热休克蛋白Hsp70,另外两种为真核细胞的功能蛋白。对于马杜霉素抗药性机制的研究，姜连连等(2006)利用双向电泳技术,对柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株与敏感株的蛋白质表达图谱进行差异比较和分析,发现两者之间差异有4个蛋白质斑点,其中1种蛋白质为球虫子孢子表面抗原 TA4。另外2种蛋白质与疟原虫的 Pfj1和线粒体转运蛋白受体Tom40具有很高的同源性。安健(2006)对马杜霉素敏感虫株和抗药虫株进行mRNA差异显示比较分析，结果显示HCD1序列来自马杜霉素敏感虫株,而在抗药虫株中的沉默，AGD5在敏感虫株裂殖子中沉默,HAD8-2在抗药虫株中沉默。对于地克珠利与马杜霉素抗药性机制研究：韩红玉等(2005)利用抑制消减杂交(SSH)方法，通过两轮杂交和两次PCR分别构建了富含两个抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库。结果发现，有4个cDNA 片段可能是新基因片段，与地克珠利抗药株的产生有关；有3个新的cDNA片段可能与马杜拉霉素抗药株的产生有关。蔡兰等(2006)分析比较柔嫩艾美耳球虫地克珠利和马杜拉霉素抗药株与敏感株孢子化卵囊18S rDNA基因的差异，结果显示, ETAM株有3个碱基发生突变;ETAD株有l个碱基发生突变。刘文江等(2004)对柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳,构建了稳定的双向电泳图谱。结果发现地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有4个表达差异点。对于盐霉素、拉沙里菌素抗药性机制研究：余丽芸等(1999)采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳,进行了盐霉素、拉沙里菌素抗药虫株与敏感虫株间乳酸脱氢酶(LDH), 葡萄糖磷酸异构酶(GPI)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)等同工酶的分析。柔嫩艾美耳球虫抗性虫株的LDH 酶谱是2条带,敏感虫株是3条带。国内学者采用多种技术对遗传背景相同的球虫抗药株和敏感株之间基因和蛋白表达差异进行了大量研究,且对不同药物抗鸡球虫的分子作用机理研究着重于对药物作用可能相关的基因和蛋白。这些相关基因和蛋白是球虫入侵、代谢及信号传导途径中的关键分子。药物作用后，这些基因或蛋白的表达量发生了不同程度的变化，但是有关某种药物确切的调控机理及其相互之间的作用关系，还需要进一步深入的研究。

表3 国内关于鸡球虫抗药性的研究调查Tab.3 Researches on the resistance of chicken coccidia in China

随着分子生物学技术的快速发展，通过实验室分离或诱导抗药球虫株，比较药物敏感株和抗药株在这些药物可能作用的基因，筛选可能的抗药基因的突变区域和突变位点，寻找药物作用的靶基因位点，并通过转基因技术对这些基因位点进行验证。抗球虫药物的靶基因或靶基因位点的发现对深入揭示球虫对特定药物抗药性产生机制、建立球虫抗药性分子检测技术、预防和控制抗药性的产生，以及新型作用机制抗球虫药的研制具有重要意义。

5 结语

由于鸡球虫病对养鸡业的危害十分严重,人们对鸡球虫病及其药物防治的研究从未间断过,并取得了很大的进展。虽然人们研制和开发了很多种抗球虫药物控制鸡球虫病的发生,但是该病的危害仍相当严重。药物在一段较长的时间内仍然是防治鸡球虫病的主要武器。球虫对药物极易产生耐药性,因此加强药物开发的研究势在必行。研制中西药复方制剂用于防治鸡球虫病将是一个新的思路。药物开发除不断挖掘新药外,需不断改变剂型、发挥老药的作用。同时还应注意进行抗球虫药与饲料中其他药物的配合使用方面的研究。