王坚 胡明冬 唐晓丹 葛海燕 彭正羽 宋元林 夏世金

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是极高致死率和极高致残率的病理生理综合征，被冠以“假恶性”肿瘤之称[1]，严重危害人们的健康，尚没有根治的方法。低氧性肺血管结构重建(hypoxic pulmonary vascular structural remodeling, HPVSR)是HPH形成的基本病理生理特征之一[2-3]。平滑肌细胞是组成肺血管壁最重要的细胞，低氧所致的肺平滑肌细胞结构与功能异常是HPH形成的一种主要病理生理机制。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscular cells, PASMC)是组成肺动脉结构的主要细胞之一，在HPH形成中的作用至关重要。低氧能导致PASMC异常增殖，促进HPVSR，加速HPH发生与发展[2，4-6]。基于PASMC结构异常在HPH发生和发展中的关键作用，抑制PASMC异常增殖已成为HPH靶向治疗的研究热点。

近年来备受关注的环状RNA(circular RNA, circRNA)有可能为阐明HPH的机制提供新方法。circRNA通过与疾病关联的miRNA相互作用在疾病中发挥着重要的调控作用，为阐明疾病发生机制、干预靶点和新型诊断标志物提供了新手段和新策略[7-9]。

我们前期的研究发现，对HPH模型小鼠肺组织进行circRNA芯片筛选和qRT-PCR验证，结果表明HPH模型组(与常氧组比较)小鼠肺组织中环状RNA mmu-circ-0001033表达显著下调[10]，由此推测环状RNA mmu-circ-0001033可能参与HPH发生机制。为了阐明 mmu-circ-0001033在HPH形成中的作用，我们进行环状RNA mmu-circ-0001033过表达对低氧性PASMC增殖的影响实验。本实验通过慢病毒介导mmu-circ-0001033转染体外培养的小鼠PASMC，观察增强mmu-circ-0001033表达对低氧性PASMC增殖的影响，为进一步研究mmu-circ-0001033在调节HPH中的作用与机制提供实验依据。

材料与方法

一、材料及主要试剂

10只健康雄性C57BL/6小鼠(购自上海杰思捷动物有限公司)。CCK-8(Cell Counting Kit)试剂盒(上海碧云天)、DMEM高糖培养基(Gibco，USA)、0.25%胰蛋白酶(Gibco，USA)、胎牛血清(Gibco，USA)、细胞培养板和培养瓶(Corning，USA)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma，USA)；Nanovue的分光光度计(美国GE公司)；自动常压缺氧孵箱(德国贺氏公司)。其余试剂是国产分析纯。

二、实验方法

1. 原代PASMC的培养与分组: 采用贴块法培养细胞。取健康雄性C57BL/6小鼠，10%乌拉坦腹腔注射麻醉后，在无菌条件下打开小鼠胸腔取出肺动脉干和左右肺动脉，纵向剪开血管壁，用眼科弯镊钝性刮除残余的血管内膜，用含有抗菌素的PBS反复冲洗，将中膜剪成1 mm×1 mm大小，用弯头滴管移入到培养瓶内，组织块之间距为0.5 cm左右。将植块面翻转，置于培养箱中。2 h后轻轻翻转并加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，组织块浸泡在培养液，静置1周。1周后观察及换液。用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞。当细胞生长至铺满瓶底80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞在光镜下呈典型的峰-谷状表现，免疫细胞化学染色观察抗α-平滑肌肌动蛋白抗体染色阳性，鉴定细胞。取3～5代细胞用于本实验。低氧处理：置入自动常压缺氧孵箱(德国贺氏公司)进行低氧处理。氧浓度：常氧21% O2，低氧2.5% O2。实验分4组：常氧组、低氧组、mmu-circ-0001033过表达慢病毒转染+低氧组、空白载体慢病毒转染+低氧组。

2. mmu-circ-0001033过表达慢病毒构建

(1)慢病毒包装：制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，使用质粒载体进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h更换为完全培养基，培养48 h和72 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，4 ℃，2 000×g，离心10 min，去除细胞碎片，然后收集病毒上清液，再行超离。4 ℃，82 700×g，离心120 min，对其超离，最后得到高滴度的慢病毒超离液。

(2)滴度检测：①细胞准备：将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100 μl/孔，为每个病毒准备6个孔。放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养; ②加病毒：第2天，准备6个1.5 ml EP管，第一个EP管中加入10 μl病毒液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度; ③追加培养液：第3天，有需要加嘌呤霉素筛选的孔，先吸去100 ml含病毒培养基，加入100 μl含1.5 μg/ml 嘌呤霉素的10% FBS完全培养基; ④观察结果并计算滴度：第5天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前6 h需更换新鲜10%胎牛血清的完全培养基，从孔中吸出80 μl培养基，然后加入80 μl新鲜10%胎牛血清的完全培养基，放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养。6 h后荧光显微镜下观察结果，荧光百分比在10～30%的孔计算病毒滴度。滴度(TU/ml)=细胞数×荧光百分比×MOI×病毒稀释倍数×103。

3. 慢病毒载体转染: 取PASMC铺于96孔培养板，每组设3个重复孔。mmu-circ-0001033过表达慢病毒经扩增、鉴定、纯化后用于本实验。待细胞长至80%时，培养24 h后弃培养液，然后吸出培养液，加入mmu-circ-0001033过表达慢病毒或空白载体慢病毒转染液，在37 ℃、5% CO2细胞孵箱培养1 h后弃转染液。未转染组不加慢病毒转染液，其余同转染组。后续在常氧(21% O2)和低氧(2.5% O2)条件下进行相应指标检测，重复实验3次。

4. qRT-PCR技术检测细胞mmu-circ-0001033的表达水平： 采用Trizol法分别提取各组细胞的总RNA。用Nanovue的分光光度计测定各组RNA浓度。运用Takara逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA以用于后续的qRT-PCR检测。应用Bio-Rad公司的PCR仪进行qRT-PCR检测。引物序列如下：GAPDH-F: 5′-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；GAPDH-R：5′-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3′；mmu-circ-0001033-F： 5′-CTGTCCCAACTGTAAAGAAGGTG-3′；mmu-circ-0001033-R：5′-CATCGGTTTGGTGCTCCTC-3′。

5. CCK-8法检测细胞增殖: 主要操作步骤：①在96孔板中配置100 μl的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24 h(37 ℃，5% CO2)；②向培养板加入10 μl不同浓度的待测物质；③将培养板在培养箱孵育所设定的时间；④向每孔加入10 μl CCK-8溶液；⑤将培养板在培养箱内孵育1～4 h；⑥用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

三、统计学方法

结 果

一、 低氧下调PASMC中mmu-circ-0001033的表达

低氧诱导PASMC中mmu-circ-0001033的表达明显下调，且呈时间依赖性。见图1。

图1 低氧诱导PASMC中mmu-circ-0001033的表达下调；与Control组比较，*P<0.05，**P<0.01，n=3

二、 mmu-circ-0001033过表达慢病毒转染结果

与对照组比较，慢病毒转染组中mmu-circ-0001033表达显著上调(P<0.05)，提示mmu-circ-0001033过表达慢病毒成功转染入PASMC，且并高效表达，见图2。

图2 mmu-circ-0001033过表达慢病毒成功转染PASMC；与Control组比较，*P<0.05，n=3

三、 CCK-8法检测细胞增殖结果

与常氧组比较，低氧组和空白载体慢病毒转染+低氧组PASMC增殖明显增多(P<0.05)，而mmu-circ-0001033过表达慢病毒转染+低氧组PASMC增殖显著下降。说明过表达的mmu-circ-0001033 显著抑制低氧所诱导的PASMC的增殖，见图3。

图3 细胞增殖检测结果；注：1～4：常氧组、低氧组、空白载体慢病毒转染+低氧组、mmu-circ-0001033过表达慢病毒转染+低氧组；与Control组比较，**P<0.01，n=3

讨 论

本实验研究首次发现，低氧可导致PASMC异常增殖和mmu-circ-0001033的表达明显下调，而慢病毒介导的mmu-circ-0001033过表达能显著抑制低氧所诱导的PASMC的增殖，提示增强mmu-circ-0001033表达可抑制PASMC的增殖，这为mmu-circ-0001033过表达改善HPVSR，从为而防治HPH提供了实验依据。

circRNA作为RNA家族成员，具有特征性的共价闭合环结构的特征性。circRNA具有种属、组织、疾病及发育阶段等的特异性，与多种疾病，尤其是恶性肿瘤的发生发展密切相关。circRNA的主要功能是通过海绵吸附miRNA发挥生物学功能，同时还具有调控转录和转录后过程、可变剪接、编码蛋白以及充当蛋白诱饵等作用。目前多种预测方法被提出用于发现circRNA[8]。

目前认为，circRNA是存在于生物中具有共价闭合环结构特征的非编码RNA[11]。circRNA曾经被认为是RNA剪切所形成的错误产物而轻视为“垃圾”[12-13]。然而，科学家们应用高通量测序确认circRNA是细胞基因表达的一种形式[14]。研究还发现circRNA具有保守性、稳定性、多样性和丰富性，参与调节胞内其他RNA的功能，在恶性肿瘤、心血管疾病、神经精神性疾病、先兆子痫以及2型糖尿病等发生发展中发挥着关键的作用[8]。

circRNA在心血管疾病发生和发展过程中发挥了重要作用。Burd等[15]发现，在动脉粥样硬化性血管疾病中来自INK4A/ARF位点的环状RNA(cANRIL)的表达量与INK4A/ARF的转录以及动脉粥样硬化性血管病发生风险密切相关，其机制可能是cANRIL募集PcG复合物导致INK4A/ARF的沉默，增加了动脉粥样硬化性血管病发生的易感性。Wang等[16]发现，环状RNA(HRCR)能够海绵吸附miR-223，抑制miR-223的活性，促进ARC蛋白表达上调，进而抑制心肌肥厚和心衰的发生。Foxo3 circular RNA能够抑制抗衰老和抗应激相关蛋白，促进阿霉素诱导的心肌病的发生[17]。 Geng等[18]发现环状RNA(Cdr1as)能够海绵吸附miR-7a上调PARP和SP1蛋白的表达，进而增加心梗的面积，提示Cdr1as有望作为心梗的治疗靶点。本研究提示，环状RNA mmu-circ-0001033在肺动脉高压发生中可能具有重要作用。

慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (human immunodeficiency virus-1，HIV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染和稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。体外和体内实验中慢病毒己经成为表达外源基因的常用载体之一， 且正在获得越来越广泛的应用。基于慢病毒载体的优势，本研究构建了mmu-circ-0001033过表达慢病毒载体，实现了mmu-circ-0001033在PASMC中进行稳定且高效的表达，为研究mmu-circ-0001033的生物学功能提供强有力的手段。

然而，本研究仅仅观察到低氧下调PASMC mmu-circ-0001033表达，以及慢病毒介导的mmu-circ-0001033过表达能显著抑制低氧所诱导的PASMC的增殖，但对其机制尚不清楚；此外，本研究的结论也需要进行动物实验，更需要用HPH临床样本进行验证。

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