陈明权，彭富全，何风雷，农根林

(广州白云山陈李济药厂有限公司，广东 广州 510288)

牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的干燥根[1]，俗称山莲藕、血藤、九龙串珠、牛古大力、大力薯。牛大力性平味甘，具补虚润肺、强筋活络之功效，临床证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎等有一定疗效[2]。牛大力为岭南地区药食两用植物，是舒筋健腰丸、壮腰健肾丸等名优产品的重要原料之一。现代研究表明，牛大力药材中主要含有刺桐碱、高丽槐素和芒柄花素等化学成分[3-5]；其中刺桐碱具有增强细胞毒性、抗焦虑、抗痉挛和DPPH自由基清除作用[6]，高丽槐素具有抗补体作用，对白血病细胞(HL-60)和大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(RBL-2H3)具有细胞毒活性[7-8]。

陈勇等[9]以芒柄花素和高丽槐素为指标成分，建立了测定牛大力药材中芒柄花素和高丽槐素含量的方法；但结果表明，8个批次的牛大力中芒柄花素的含量均较低(≤0.002%)；因此，该成分作为质量控制指标的实际意义不大。本文首次以刺桐碱和高丽槐素作为指标性成分，建立了牛大力药材中刺桐碱和高丽槐素含量的测定方法，为牛大力药材的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱议(美国安捷伦公司)；Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司)；Millpore simplicity-67120型超纯水器(美国密理博公司)；BS110S型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；WXJ型粉碎机(上海凯旋中药机械制造有限公司)；KQ-100DV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

牛大力药材分别采集或购自广东电白(S1～S2)、云南勐海(S3～S4)、广州清平中药材市场(S5～S6)，经广州中医药大学中药鉴定教研室主任黄海波副教授鉴定为豆科植物美丽崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的根。对照品刺桐碱(成都普菲德生物技术有限公司，供含量测定用，批号：140428，纯度：98%)；高丽怀素(成都普菲德生物技术有限公司，供含量测定用，批号：131025，纯度：98%)；乙腈(Fisher，色谱纯)；冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；液相用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件

色谱柱为Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，按程序梯度洗脱(0～12 min，10%乙腈；12～13 min，10%～40%乙腈；13～35 min，40%乙腈)，检测波长为280 nm(0～13 min)和310 nm(13～35 min)，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。在该条件下，混合对照品及牛大力样品的色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.牛大力样品；1.刺桐碱；2.高丽槐素。图1 混合对照品和牛大力样品HPLC图

2.2 供试品溶液的制备

取牛大力样品粉末1.00 g(过45目筛)，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，称定重量，超声提取40 min，放冷至室温，补重，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 混合对照品溶液的制备

分别精密称取对照品刺桐碱7.11 mg、高丽槐素2.17 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为142.2、43.4 μg·mL-1的混合对照品溶液，4 ℃保存备用。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品溶液2、4、6、8、10 μL，按2.1项色谱条件进样分析，以各成分峰面积Y为纵坐标，以进样量X(μg)为横坐标，绘制标准曲线，并求出刺桐碱和高丽槐素的回归方程分别为Y=1 231.5X-8.68(r=0.999 9)和Y=1 309.3X-7.24(r=0.999 8)。结果表明，刺桐碱和高丽槐素的进样量分别在0.284 4～1.422 0 μg和0.087 0～0.435 2 μg与峰面积值呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测得峰面积积分值，计算相对标准偏差，结果刺桐碱的RSD=0.89%，高丽槐素的RSD=1.73%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，分别在0、3、6、12、24、48 h按2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算得刺桐碱的RSD=1.37%，高丽槐素的RSD=1.52%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一供试样品6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行HPLC分析。测得峰面积积分值，计算相对标准偏差，结果刺桐碱的RSD=1.42%，高丽槐素的RSD=1.91%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已测定的牛大力药材(编号：S1)粉末1.0 g，共6份，分别精密加入刺桐碱对照品溶液(质量浓度为2.04 mg·mL-1)和高丽槐素对照品溶液(质量浓度为0.13mg·mL-1)各1 mL，按供试品溶液制备方法制备，进样10 μL，注入HPLC色谱仪，测其峰面积，计算回收率。刺桐碱平均回收率为99.6%，RSD=1.57%(n=6)，高丽槐素平均回收率为100.9%，RSD=2.18%(n=6)。结果见表1、表2。

表1 牛大力中刺桐碱加样回收率试验结果

表2 牛大力中高丽槐素加样回收率试验结果

2.9 样品的测定

取6批牛大力样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定含量，结果见表3。

表3 牛大力样品中刺桐碱、高丽槐素含量测定结果(n=2)

3 讨论

3.1 HPLC色谱条件的优化

3.1.1 流动相组成系统的优化 考察了甲醇-水、乙腈-水及在流动相中添加不同浓度的冰醋酸对样品分离的影响，结果表明采用乙腈-0.1%冰醋酸水溶液对刺桐碱、高丽槐素成分的分离有明显改善；采用梯度洗脱较等度洗脱能明显改善各特征峰的分离效果，既能满足基线分离的要求，又有适宜的保留时间；故实验选用乙腈-0.1%冰醋酸水溶液作为流动相并采用梯度洗脱方式。

3.1.2 检测波长的选择 HPLC-PDA 分析结果表明，2个指标成分刺桐碱、高丽槐素最大吸收波长分别为280、310 nm。因此，选择280、310 nm分别作为刺桐碱、高丽槐素的检测波长，在两个波长下，表观峰度高、峰形较好且基线稳定。

3.2 药材提取方法的优化

采用正交试验法考察了超声提取时间(40、60、80 min)、提取溶剂(50%、70%、90%乙醇水)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30)对牛大力药材中刺桐碱、高丽槐素成分的提取效率，结果表明，刺桐碱的最佳提取工艺为超声提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶10)，其中料液比“1∶10”与“1∶20”对刺桐碱含量的影响不存在显著差异。高丽槐素的最佳提取工艺为超声提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶20)，其中料液比“1∶10”与“1∶20”对高丽槐素含量的影响存在显著差异。综合考虑，牛大力最佳提取工艺选择为超声提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶20)。

3.3 小结

测定了不同来源的6个批次的牛大力药材中刺桐碱和高丽槐素的含量，其药材的HPLC色谱图基本一致，但药材中刺桐碱和高丽槐素含量具有一定差异性。本文建立了以刺桐碱、高丽槐素为指标成分的牛大力药材的含量测定方法，方法简便、准确、稳定性好，为牛大力药材质量控制提供了新的参考。

[1] 广东中药志编辑委员会.广东中药志：第一卷[M].广州：广东科学技术出版社，1994：168.

[2] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编：上册[M].3版.北京：人民卫生出版社，1986：200.

[3] 张宏武，丁刚，李榕涛，等.牛大力中刺桐碱的分离鉴定和含量测定[J].药物分析杂志，2011，31(6)：1024-1026.

[4] 宗鑫凯，赖富丽，王祝年，等.牛大力化学成分研究[J].中药材，2009，32(4)：520-523.

[5] 王春华，王英，王国才，等.牛大力的化学成分研究[J].中草药，2008，39(7)：972-975.

[6] 唐峥嵘，王利勤，叶广达.刺桐属植物的生物碱成分及其药理作用研究进展[J].广州化工，2012，40(2)：43-46.

[7] 何常明.苦参和山豆根黄酮类成分及其生物活性的比较研究[J].上海：复旦大学，2010.

[8] Uchiyama T，Furukawa M，Isobe S，et al.New oleanane-type triterpene saponins from Millettia speciosa[J].Heterocyeles，2003，60(3)：655-661.

[9] 陈勇，谢臻，巫繁菁，等.HPLC测定广西牛大力药材中芒柄花素和高丽槐素的含量[J].世界科学技术—中医药现代化，2013，15(2)：260-263.