李东，宗梁，郝福，高雯，张纲，李志刚*

[1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.京津冀联创药物研究(北京)有限公司，北京 100083]

七味双花柴胡胶囊，属于国家六类中药新药，由金银花、柴胡、连翘、黄芩、清半夏、西洋参、绵马贯众七味药材组成，具有透邪解毒、清肺泄热之功能，主要用于治疗病毒性上呼吸道感染属风热证[1]。原汤剂临床疗效确切，但由于治疗周期长，不便于患者用药。原汤剂药物性质多为水溶性成分，故为便于患者服用携带方便，保持原方剂疗效，依据现代临床应用和制剂技术，对其中5味药材进行水提，经醇沉去杂干燥后的浸膏粉与剩余2味药材的粉末及提取物粉混合制成胶囊剂。本实验在单因素试验的基础上采用响应面设计[2](RSM)，以君药金银花绿原酸为指标，对七味双花柴胡胶囊的提取工艺进行研究，为产品生产提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

戴安U3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多)；电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2 试药

绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110753-201415)；乙腈(色谱纯)；甲醇、乙醇、磷酸均为分析；纯化水(自制，超纯水)。

药材均来自神威药业集团有限公司，经公司质控部检验，均符合2015年版《中华人民共和国药典》[3]。

2 实验方法

2.1 测定方法

2.1.1 色谱条件 Cosmosil C18色谱柱(250 mm×4.5 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水(13∶87)；检测波长为327 nm；流速为1.0 mL·min-1，理论塔板数按绿原酸计算应不低于3000。

2.1.2 供试品溶液的制备 取七味双花柴胡胶囊金银花等五味药材的提取液3 mL，精密量取，置20 mL锥形瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品，精密称定，加50%甲醇制成质量浓度为42.15 μg·mL-1的对照品溶液。

2.1.4 线性关系考察 自动进样对照品溶液4、6、8、10、12 μL，按色谱条件测定，以质量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，线性回归方程为Y=49.994X-0.0602，r=0.999 7，结果表明，绿原酸在0.168 6～0.505 8 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 方法学考察 专属性试验表明，阴性对照无干扰，供试品溶液24 h内稳定(RSD为0.66%)，精密度好(RSD为0.29%，n=6)，重复性好(RSD为0.86，n=6)，平均加样回收率为100.96%(RSD为1.88%，n=6)。将供试品溶液和对照品溶液分别进样10 μL，按外标法计算样品中绿原酸含量。

注：A.七味双花柴胡胶囊干膏样品；B.七味双花柴胡胶囊干膏阴性样品；C.绿原酸对照品；D.空白；1.绿原酸。图1 七味双花柴胡胶囊提取液液相色谱图

2.2 水提工艺单因素试验

设定其他因素条件不变的情况下，依次平行进行试验，分别考察提取次数、加水量、提取温度、提取时间对绿原酸提取量的影响。

表1 水提工艺单因素试验

2.3 水提工艺响应曲面试验设计

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[4]，综合单因素影响试验，选取加水量(A)、提取温度(B)、提取时间(C)作为考察对象，以绿原酸提取量为响应值，采用Design-Expert 8.0.6(试用版)实验设计软件的响应面分析法安排试验，研究其对绿原酸提取量的影响。采用3因素3水平的响应面分析法进行试验设计[5]，见表2。

表2 响应面分析因素水平及编码

3 结果与分析

3.1 水提工艺单因素试验结果与分析

3.1.1 提取次数对绿原酸提取率的影响 按2.2项下方法以绿原酸提取率分别考察提取次数对绿原酸提取情况的影响，结果见图2(A)。结果表明，提取两次已经基本提取完全，第三次以后绿原酸已经提取的较少，考虑到工业化成本且保证提取效果，故确定提取次数为两次。

3.1.2 加水量对绿原酸提取率的影响 按2.2项下方法以绿原酸提取率分别考察加水量对绿原酸提取情况的影响，结果如图2(B)。结果表明，随着加水量的增加，绿原酸提取率不断升高，(8倍量/8倍量)～(8倍量/8倍量)增加较(10倍量/8倍量)～(10倍量/10倍量)明显，后续逐渐平缓，考虑到后续浓缩，故选择以10倍量水作为中心点。

3.1.3 提取温度对绿原酸提取率的影响 按2.2项下方法以绿原酸提取率分别考察提取温度对绿原酸提取情况的影响，结果如图2(C)。结果表明，提取温度从80～100 ℃(煮沸)，绿原酸提取率在90 ℃出现峰值，故选90 ℃作为中心点。

3.1.4 提取时间对绿原酸提取率的影响 按2.2项下方法考察提取时间对绿原酸提取情况的影响，结果如图2(D)。结果表明，随着提取时间的增加，绿原酸提取率逐渐降低，考虑到工业化生产及其他因素的影响，选择1 h作为中心点。

注：A.提取次数；B.加水量；C.提取温度；D.提取时间。图2 提取次数、加水量、提取温度、提取时间对绿原酸提取率的影响

3.2 响应面试验结果及分析

3.2.1 响应面试验结果 对影响绿原酸提取量影响较大的加水量(A)、提取温度(B)、提取时间(C)3因素作3水平的响应面试验设计，所得结果见表3。

表3 响应面法试验设计方案及结果

3.2.2 结果分析 通过Design-Expert 8.0.6(试用版)实验设计分析软件对表3的结果进行统计分析(见表4)，得到绿原酸提取量对提取温度(A)、加水量(B)、提取时间(C)的二次多项回归模型：绿原酸提取量=1.13-0.063×A+0.022×B-0.17×C-0.032×AB-1.025×10-3×AC-0.031×BC-0.12×A2-0.036×B2+5.433×10-3C2(r=0.989 1)。

由拟合回归方程的相关系数可知，模型拟合程度良好，可以用此模型对七味双花柴胡胶囊提取工艺进行分析和预测；由表4可知，所建立的二次多项式模型具有高度的显著性(P<0.01)，模型的失拟项的P值为0.310 0，大于0.05，无显著性差异，说明模型选择合适，该模型的r=0.989 1，表明自变量与响应值之间线性关系显著，回归方程的各项方差分析影响因素从大到小排序为：提取时间>提取温度>加水量。

各影响因素和响应值构成三维空间的曲面图和二维平面图上的等高线图能直观地反应出各因素的相互作用以及对综合评分结果的影响，在三因素的范围内，以绿原酸提取量最大值为目标，固定三因素之一，得到剩余两因素与绿原酸提取量的响应三维图和等高线图，结果见图3～4。

表4 方差分析

注：**P<0.01；*P<0.05。

图3 各因素交互作用对绿原酸提取量影响的3D响应面图

图4 各因素交互作用对绿原酸提取量影响的等高线图

由图3、图4可知，提取温度和加水量、加水量和提取时间对绿原酸提取量影响显著，以绿原酸提取量为最大值，经过以上对回归模型响应面的三维立体图分析，最佳提取条件：提取温度为86.41 ℃，加入11.75倍量水，提取时间为0.50 h。

3.3验证试验

按上述优化最佳提取条件平行进行3次验证试验，绿原酸提取量分别为13.18、13.20、13.12 g，平均值为13.17 g，RSD=0.32%，与理论实验值的相对误差为1.67%。说明验证值与回归方程预测值吻合较好，模型优化结果准确可靠。

4 结论与讨论

结合单因素和Box-Behnken设计试验，对影响七味双花柴胡胶囊的提取工艺的4个因素(提取温度、提取时间、加水量、提取次数)进行考察分析，采用Design-Expert 8.0.6(试用版)软件对结果进行分析，得到绿原酸提取量的最佳提取条件：提取温度86.41 ℃，加入11.75倍量水，提取0.50 h/次，提取2次。

样品中绿原酸含量采用高效液相法进行测定。在供试品溶液配制中，对提取溶剂、提取溶剂用量、超声时间等因素均进行了优选研究，确定了最佳配制方法。

七味双花柴胡胶囊各味药材主要含绿原酸、苷类、皂苷类、对羟基酚性成分[6-10]，多溶解于水，根据处方传统用药方式和各味药的理化性质，更主要因为与其临床上使用水煎提取保持一致，故采用水提取方式。

Box-Behnken试验设计是可以评价指标和因素间的非线性关系的一种试验设计方法，和中心复合设计不同的是其不需要连续进行多次试验，并且在因素数相同的情况下，Box-Behnken试验组合数比中心复合设计少，因而更经济，同时也避免了传统正交设计和均匀设计法的不足，兼顾了多个影响因素和评价指标，优选的工艺简便合理、稳定，预测结果具有较高的准确性，为中药提取工艺优化提供了依据。

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