李 灵,徐梁棕,汪少芸

(福州大学生物科学与工程学院,福建 福州 350116)

0 引言

我国是罗非鱼养殖大国,罗非鱼的加工主要以罗非鱼片为主,由此产生的下脚料鱼鳞通常作为废弃物处理,不仅浪费资源,且污染环境[1]. 有研究表明,鱼鳞富含胶原蛋白和角蛋白等硬蛋白[2],其中胶原蛋白可广泛应用于生物材料、 组织工程、 医疗、 食品、 化妆品、 饲料等领域. 利用酸、 碱或者酶使胶原蛋白降解形成胶原多肽,它比胶原蛋白在消化吸收、 营养、 功能特性等方面都有显著提高. 近年来,已经有许多关于鱼皮胶原蛋白和鱼鳞胶原蛋白的提取和生物活性如抗氧化性[3-5],低温保护活性[6-8],降血压活性[9]等方面的报道,但利用蛋白酶直接酶解鱼鳞制备多肽的工艺研究报道较少. 本研究以罗非鱼鱼鳞为原料,经超声和高温预处理后, 以水解度和DPPH自由基清除率为指标, 利用响应面分析法对罗非鱼鱼鳞酶解工艺进行优化,得到罗非鱼鱼鳞胶原多肽最佳提取工艺,测定冻干后的酶解多肽的抗氧化活性和细菌低温保护活性,同时分析其氨基酸组成及相对分子质量分布.

1 材料与方法

1.1 材料

罗非鱼鳞,购自厦门源水食品有限公司； 复合风味蛋白酶,购自广州市华琪生物技术有限公司； 碱性蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 胰蛋白酶,购自上海诺维信公司； M17 肉汤培养基,购自青岛高科园海博生物技术有限公司； 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),分析纯,购自美国Sigma公司； FeSO4、 水杨酸、 H2O2,购自国药集团化学试剂有限公司； 嗜热链球菌由上海交通大学农业与生物学院提供； 其他试剂均为国产分析纯.

1.2 主要仪器

HC-700高速多功能粉碎机(永康市天祺盛世工贸有限公司)； KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； XZ-21K高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)； UV-2600紫外可见分光光度计(上海UNICO设备公司)； FE20 pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)； AUY120电子天平(日本岛津公司)； FD-1C-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司). YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯医疗设备厂)； SW-CJ-1D型单人净化工作台(上海苏净实业有限公司)； 海尔医用低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 罗非鱼鱼鳞酶解工艺流程

鱼鳞→清洗,烘干→粉碎成絮状→50 ℃,200 W功率超声90 min→121 ℃,0.1 MPa高温处理1 h→冷却→调节pH值→加酶水解→沸水浴灭酶→离心→上清液→冷冻干燥→样品

1.3.2 中心组合试验设计

表1 响应面法的因素水平编码表Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

在单因素试验基础上,得到酶添加量2.14 mg·mL-1(其中胰蛋白酶1.44 mg·mL-1,碱性蛋白0.70 mg·mL-1),酶解pH值8.5,且通过SPSS软件分析得到这两个因素对酶解效果影响不显著； 而底物质量浓度、 酶解温度和酶解时间3个因素对酶解效果影响显著. 因此将这3个因素作为响应面的优化因子,根据Box-Behnken 实验中心设计原理,利用软件Design-Expert V8.0.6 对实验结果进行响应面分析(见表1),获得罗非鱼鱼鳞最佳酶解工艺条件.

1.3.3 水解液游离氨基酸总量

酶解液水解度的测定参照甲醛滴定法[10].

1.3.4 样品的冷冻干燥

根据最佳酶解条件酶解罗非鱼鱼鳞,之后以10 000 r·min-1离心10 min,收集上清液,冷冻干燥得到鱼鳞胶原多肽粉末.

1.3.5 抗氧化活性测定

DPPH自由基清除活力参照Wu等[11]的方法进行测定. 用95%(体积分数,以下同)乙醇配置DPPH·固体粉末最终得到浓度为0.1 mmol·L-1的溶液,避光保存备用. 用超纯水溶解胶原多肽粉末,分别配成浓度为0.2～10 mg·mL-1样品,然后取1 mL的各浓度样品与1 mL DPPH·溶液充分混匀,室温避光静置30 min,517 nm测定吸光值； 用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH·溶液为样品参比组； 空白组为1 mL DPPH·溶液与1 mL 95%乙醇溶液. 样品的DPPH自由基清除活力根据下式进行计算：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

其中：Ai表示样品组吸光值；Aj表示样品参比组吸光值；A0表示空白组吸光值.

羟基自由基清除率按Zhang[3]的方法测定. 用超纯水将胶原多肽粉末配成浓度为0.2～10 mg·mL-1的样品,分别取1 mL各浓度样品与0.3 mL浓度为8 mmol·L-1的FeSO4、 1 mL浓度为3 mmol·L-1的水杨酸以及0.25 mL浓度为20 mmol·L-1的H2O2混匀,37 ℃保温30 min,流水冷却后,加入0.45 mL蒸馏水使反应液总体积达3 mL,4 884 r·min-1离心10 min,于510 nm波长下测定上清液吸光值,蒸馏水代替样品作为空白对照.

羟基自由基清除率(%)=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100

1.3.6 细菌低温保护活性

从新鲜的斜面保菌管上接种嗜热链球菌到M17培养基中,活化18 h作为种子液； 再将嗜热链球菌以0.5%的体积比例从种子液接种到液体培养基中培养4 h,此时菌液的OD600=1.25,取1 mL菌液梯度稀释至10-5,从中取100 μL菌液再加入900 μL胶原多肽溶液混匀,取40 μL涂布,每个样品做两个平行,37 ℃倒置培养24 h,进行菌落计数. 剩余部分于-20 ℃下放置24 h后,按照如前步骤涂布、 培养、 计数. 参照Wang等[12]方法,根据 NA/NB×100%计算存活率,NA是冷冻前菌落数,NB为冷冻后菌落数.

1.3.7 氨基酸组成测定

采用上海交通大学分析测试中心全自动氨基酸分析仪(L-8900,Hitachi 公司). 样品前处理： 称样品于水解管中,加入6 mol·L-1HCl,抽真空吹氮气,重复3 次后封口,110 ℃水解24 h. 转移定容后过滤,取滤液在加NaOH 的真空干燥器中蒸干,加盐酸溶解,上机测定. 色谱柱尺寸： 4.6 mm×60 mm,3 μm； 树脂： Hitachi 公司氨基酸分析仪专用阳离子交换树脂； 上样量为20 μL.

1.3.8 HPLC测定相对分子质量

采用江南大学食品科学与技术国家重点实验室Waters TM650E 高效液相色谱仪(配2487 紫外检测器和M32工作站)； 色谱柱： TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)； 流动相: 乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(体积比)； 检测波长： UV 220 nm； 流速： 0.5 mL·min-1； 柱温： 30 ℃.

2 结果与分析

2.1 响应面优化试验

根据单因素试验结果,以DPPH自由基清除率为主要指标,水解度DH为辅助指标作为响应值进行响应面优化试验,实验方案及结果见表2.

釆用Design Expert 8.05软件对表2中试验结果进行方差分析和多元回归拟合(见表3、 4),分别得到水解度DH和DPPH自由基清除率随底物质量浓度、 酶解温度和酶解时间变化的回归方程:

DH(%)=15.71+0.22×A-0.32×B+0.84×C-0.19×AB-0.34×AC+0.31×BC-0.64×A2-0.80×B2-1.18×C2

DPPH(%)=89.72+0.045×A-0.19×B+1.31×C+0.027×AB+0.18×AC+0.70×BC-0.72×A2-0.81×B2-1.78×C2

为了检验模型的实际有效性,对结果进行方差分析与显著性检验,结果见表3、 4. 对回归方程的失拟项检验：F=3.55,P=0.126 4>0.05 和F=0.80,P=0.553 6>0.05,差异不显著； 通过对两表分析可知,两个模型的P分别为0.000 4和0.000 6,说明这两个模型极显著； 对水解度和DPPH自由基清除率的回归方程进行显著性检验,发现两个模型的相关系数分别为R2=0.961 8>0.95 和R2=0.956 6>0.95,说明模型拟合程度较好. 分析这两个模型各个系数的P值,发现因素C、A2、B2、C2对水解度的影响较显著(P<0.01),因素B对水解度的影响显著(P<0.05)； 因素C、C2对DPPH自由基清除率的影响极显著(P<0.001),因素B、BC、A2、B2对DPPH自由基清除率影响显著(P<0.05). 表明酶解温度和酶解时间对罗非鱼鱼鳞酶解效果的主效应明显.

表2 响应面试验方案与试验结果Tab.2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 回归模型的方差分析(水解度为响应值)Tab.3 Variance analysis of the regression mode(DH as response value)

注：P<0.001代表极显著***；P<0.01代表较显著**；P<0.05代表显著*；P>0.05代表不显著

表4 回归模型的方差分析(DPPH自由基清除率为响应值)Tab.4 Variance analysis of the regression mode (DPPH free radical scavenging rate as response value)

续表4 Continue table 4

注：P<0.001代表极显著***；P<0.01代表较显著**；P<0.05代表显著*；P>0.05代表不显著

由Design Expert 8.0.6软件优化得到酶解条件, 再结合单因素优化得到的酶添加量和酶解pH值, 得到的最优工艺为： 底物质量浓度30.6 mg·mL-1,酶添加量2.14 mg·mL-1,酶解pH值8.5,酶解温度50 ℃,酶解时间6.35 h,其理论水解度DH为15.88%,对DPPH自由基的清除率高达87.95%. 通过3次平行试验后测得最佳条件下水解度为(15.78±0.1)%,DPPH自由基清除率为(87.09±0.39)%,与预测值相近,这说明了回归方程与实际情况拟合良好,通过响应面优化得到的最佳工艺参数可靠、 有效,能较好预测罗非鱼鱼鳞酶解产物的水解度与DPPH自由基清除率.

2.2 罗非鱼鱼鳞酶解产物抗氧化活性

图1显示多肽复合物对DPPH·和·OH清除能力. 由图1可知,罗非鱼鱼鳞胶原多肽有较高的DPPH·和·OH清除能力,清除率随多肽质量浓度的升高而呈逐渐升高趋势. 当质量浓度为7.0 mg·mL-1时,对DPPH·和·OH的清除率达到89.59%和68.95%； 同时多肽对DPPH·的半数清除质量浓度(IC50)为2.89 mg·mL-1,对·OH的IC50为3.54 mg·mL-1. 实验结果与陈星星等[13]研究得到的罗非鱼肉及组分蛋白的酶解液对DPPH·和·OH的半数清除活性结果较一致； 王雨生等[14]研究了黄鳍金枪鱼皮胶原肽的抗氧化活性,其DPPH·和·OH的IC50分别为0.43和0.39 mg·mL-1,与之相比,本研究胶原肽的抗氧化活性较低,可能因为酶解产物是粗提物所致.

图1 多肽复合物对DPPH自由基和羟基自由基清除能力Fig.1 Scavenging activity of peptide complexes on DPPH radical and hydroxyl radical

2.3 罗非鱼鱼鳞酶解产物细菌低温保护活性

图2为低温处理前后添加空白对照(蒸馏水)、 不同质量浓度胶原多肽(1、 5、 10 mg·mL-1)和20 mg·mL-1蔗糖(商业抗冻剂)的嗜热链球菌的生长情况. 由图2可知,未经低温处理时,对照组和实验组对应的平板都长出了较多嗜热链球菌的菌落,经过24 h低温处理后,空白对照组平板的菌落数显著下降,而不同质量浓度多肽复合物组和20 mg·mL-1蔗糖组仍有部分嗜热链球菌菌落长出,这表明不同质量浓度酶解产物组和20 mg·mL-1蔗糖在低温下对嗜热链球菌有保护作用.

图2 低温处理前后添加多肽复合物的嗜热链球菌生长情况Fig.2 Growth of bacteria before and after cold treatment with the addition of peptide complexes

图3 多肽复合物对嗜热链球菌存活率的影响Fig.3 Effect of peptide complexes on the viability of Streptococcus thermophiles

图3为空白对照、 不同质量浓度多肽复合物和20 mg·mL-1蔗糖的嗜热链球菌低温保护活性. 由图3可知,加无菌水和20 mg·mL-1蔗糖的对照组经过-20 ℃、 24 h的低温处理后存活率分别为21.2%和61.3%,而添加了1、 5、 10 mg·mL-1的多肽复合物实验组的嗜热链球菌存活率分别达到75.6%、 82.8%和86.1%,与阮功成等[15]利用碱性蛋白酶水解胶原蛋白得到的复合物对大肠杆菌的低温保护效果相比,罗非鱼鳞酶解物对乳酸菌的低温保护活性相对较好. 同时,本研究制备得到的胶原肽的抗冻活性低于赵珺等[16]从鲨鱼皮明胶中制备的抗冻多肽,有可能是因为酶解产物为粗提物,未经过分离纯化. 这表明多肽复合物在低温下对嗜热链球菌有一定的保护作用,且保护效果优于商业抗冻剂.

2.4 罗非鱼鱼鳞酶解产物的相对分子质量分布

通过HPLC测定罗非鱼鱼鳞经复合酶解后多肽的相对分子质量分布,结果如图4所示. 多肽复合物主要由相对分子质量小于2 000 u(见图4(a))的小肽组成,主要分布在180～2 000 u之间,共占78%左右(见图4(b)). 因此,多肽复合物富含由10个氨基酸组成的低聚肽,短肽更有利于发挥抗氧化和低温保护细胞等生物活性.

图4 多肽复合物相对分子质量分布图Fig.4 Molecular mass distribution profile of peptide complexes as determined by HPLC

2.5 罗非鱼鱼鳞酶解产物氨基酸组成

表5 多肽复合物的氨基酸组成分析Tab.5 Amino acid compositions of peptide complexes (%)

胶原蛋白一级结构由许多重复单元(Gly-X-Y)n组成,其中X和Y是除Gly之外的任意氨基酸,X多为Pro,Y多为Hyp. 酶解产物中氨基酸组成的测定结果如表5所示,其中甘氨酸(Gly)、 脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp)的质量百分含量最丰富,这与胶原蛋白氨基酸组成的特点相一致. 同时可以发现酶解产物中丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)、 精氨酸(Arg)、 天冬氨酸(Asp)和丝氨酸(Ser)的质量百分含量较丰富. Duman等[17]研究发现抗冻蛋白或冰结构蛋白的抗冻活性与Gly、 Ala、 Thr、 Asp、 Ser相关,这些氨基酸可能是提高多肽复合物抗冻活性的关键. 张英等[18]研究了19种氨基酸对超氧阴离子和羟基自由基的抑制作用,结果发现Tyr、 Asp、 Lys、 Glu、 Met、 Gly和Asn等氨基酸对自由基的清除能力较强,而本实验中发现这类氨基酸的质量百分含量达48.35%,从而使鱼鳞胶原多肽具有较强抗氧化活性.

3 结语

采用响应面试验设计优化碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解制备罗非鱼鱼鳞活性肽,得到的最优制备条件为： 底物质量浓度30.6 mg·mL-1,酶添加量2.14 mg·mL-1,酶解时间6.35 h,酶解pH值8.5,酶解温度50 ℃. 在此条件下制备得到的胶原多肽水解度为15.88%,DPPH自由基清除率达到87.95%. 罗非鱼鱼鳞胶原肽对DPPH自由基和羟基自由基半数清除浓度(IC50)分别为2.89和3.54 mg·mL-1,表现出较好的抗氧化活性. 在细菌低温保护活性实验中,该胶原肽分别与空白对照和20 mg·mL-1蔗糖相比, 表现出了对嗜热链球菌较显著的低温保护活性(P<0.01). 胶原肽相对分子质量主要分布在180～2 000 u之间,占总量的78%左右,富含甘氨酸(Gly)、 丙氨酸(Ala)、 脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp),与胶原蛋白氨基酸组成特点相一致. 罗非鱼鱼鳞酶解物的抗氧化活性和乳酸菌低温保护活性表明,其具有在医药和食品行业中作为抗氧化剂和商业抗冻剂的潜力.

[1] 陈瑜珠, 陶红丽, 曾庆孝, 等. 利用罗非鱼加工下脚料发酵鱼露的研究[J]. 现代食品科技, 2008, 24(5): 441-443; 423.

[2] 唐旭, 何建林, 徐长安, 等. 鱼鳞胶原蛋白提取过程中的脱钙工艺条件优化[J]. 食品工业科技, 2011, 32(6): 326-328.

[3] ZHANG Y F, DUAN X, ZHUANG Y L. Purification and characterization of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates ofTilapia(Oreochromisniloticus) skin gelatin[J]. Peptides, 2012, 38(1): 13-21.

[4] 安然, 罗永康, 尤娟, 等. 草鱼鱼鳞蛋白酶解产物功能特性及其抗氧化活性[J]. 食品与发酵工业, 2011, 37(8): 76-80.

[5] 郭瑶. 罗非鱼皮胶原肽的制备及其抗氧化活性的研究[D]. 青岛： 中国海洋大学, 2006.

[6] CAO H, ZHAO Y, ZHU Y B,etal. Antifreeze and cryoprotective activities of ice-binding collagen peptides from pig skin[J]. Food Chemistry, 2016, 194: 1245-1253.

[7] WANG S Y, ZHAO J, CHEN L,etal. Preparation, isolation and hypothermia protection activity of antifreeze peptides from shark skin collagen[J]. LWT-Food Science and Technology, 2014, 55(1): 210-217.

[8] 李晓坤. 利用猪皮明胶制备抗冻多肽及其低温保护作用研究[D]. 福州： 福州大学, 2013.

[9] 周贺霞. 鱼皮降血压肽的制备及其降血压活性研究[D]. 重庆： 西南大学, 2012.

[10] ADLER-NISSEN J. In enzymatic hydrolysis of food protein[J]. Canadian Medical Association Journal, 1986, 172(8): 1783-1785.

[11] WU H C, CHEN H M. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus)[J]. Food Research International, 2003, 36(9/10): 949-957.

[12] WANG W L, CHEN M S, WU J H,etal. Hypothermia protection effect of antifreeze peptides from pigskin collagen on freeze-dried streptococcus thermophiles and its possible action mechanism[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 63(2): 878-885.

[13] 陈星星, 胡晓, 李来好,等. 罗非鱼鱼肉及组分蛋白酶解产物的抗氧化特性[J]. 食品工业科技, 2015, 36(10): 105-109.

[14] 王雨生, 冷云, 陈海华, 等. 黄鳍金枪鱼皮胶原肽酶解工艺及抗氧化活性研究[J]. 中国食品学报, 2015, 15(2): 72-78.

[15] 阮功成, 曹慧, 徐斐, 等. 胶原酶解复合物的制备及其抗冻活性[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(2): 7-12.

[16] 赵珺, 汪少芸, 李晓坤. 天然抗冻多肽的制备、 分离及细菌低温保护活性研究[J]. 福州大学学报(自然科学版), 2013, 41(1): 121-126.

[17] DUMAN J G, DEVRIES A L. Freezing behavior of aqueous solutions of glycoproteins from the blood of anAntarcticfish[J]. Cryobiology, 1972, 9(5): 469-472.

[18] 张英, 董绍华. 氨基酸清除活性氧自由基作用的研究[J]. 科技通报, 1997, 13(5): 33-36.