刘 杰，李英英，孙 哲，刘维康，刘守川，赵坤坤

（洛阳中科基因检测诊断中心有限公司，河南 洛阳 471000）

2017年5月洛阳某猪场保育猪出现咳嗽，喘气、关节肿大等症状。对3头发病猪进行剖检，取病变组织进行病原学鉴定，结果检测出猪蓝耳病毒、副猪嗜血杆菌。结合临床症状、病理变化和实验室诊断，确诊为猪蓝耳病继发副猪嗜血杆菌。

1 材料与方法

1.1 临床情况及取样

某猪场保育猪出现咳嗽，喘气，关节肿大等症状，发病率30%，死亡率20%。选取3头有发热、咳嗽并伴跛行等症状的病猪进行剖检。剖检可见心包积液增多、呈淡黄色，肺脏边缘有黄色纤维素性渗出物，肺脏尖叶和心叶出现实变，关节积液增多，颜色微黄（图1）。根据临床症状及病理情况分别采集扁桃体、肺脏等组织进行病原检测和细菌分离。

1.2 主要培养基及试剂

胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），由青岛海博试剂有限公司提供；革兰氏染色试剂， 购自北京索莱宝科技有 限 公 司；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等购自宝生物（大连）工程有限公司；细菌微量生化管及药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；病毒核酸提取试剂盒，购自台湾旭基。

1.3 方法

1.3.1 病毒样品处理

取肺脏和扁桃体健康部位与病变部位的交界处0．5 g置于灭菌平皿内，用眼科剪剪碎，置于玻璃研磨器中，并加入约1 mL灭菌PBS进行研磨。将已研磨好的组织样品匀浆液转入15 mL灭菌离心管中用灭菌的PBS定容至5 mL，取1mL至1．5 mL灭菌离心管中，液氮及室温反复冻融3次。

1．3．1．1 病毒 RNA 提取

取组织研磨液，8 000 r/min离心2 min，取上清液作为待检样品。……