王小伟，晏慧超，洪 俊

坐骨神经压迫性损伤（partial sciatic nerve ligation，PSNL）是指以坐骨神经径路及分布区域疼痛为主的综合征，坐骨神经痛的绝大多数是继发于坐骨神经局部及周围结构的病变对坐骨神经的刺激压迫与损害，其发病机制复杂多样，目前国内外对于PSNL尚无满意的治疗方法[1]。已有研究证实，芒果苷（mangiferin，MGF）是一种药理活性广泛的双苯吡酮类黄酮类化合物，具有抗糖尿病、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用[2]，具有潜在的药用价值，以及抗氧化、抗炎等方面的作用也日益被人们重视。本实验拟通过建立坐骨神经结扎模型诱发大鼠热痛敏和机械性痛敏模型，分别给予不同浓度的MGF对大鼠进行干预，通过检测热缩足反射潜伏期、机械性痛阈值及相关氧化应激因子表达，探索MGF在PSNL中的镇痛机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 SPF级Wistar大鼠60只，雌雄不限，250～300 g，华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。冯弗伦电子测痛仪（Von Frey公司）、芒果苷（Sigma公司）、戊巴比妥钠（百奥莱博公司）、注射用青霉素钠（瑞阳制药）、氯化钠注射液（安徽双鹤药业有限责任公司）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、一氧化氮（NO）含量和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、ELISA试剂盒（南京建成）、TGL-16G台式离心机（Rousselet Robatel公司）、紫外分光光度计（上海丙林）、一抗小鼠抗大鼠eNOS抗体、山羊抗小鼠二抗、DAB显色试剂盒（Santa Cruz公司，美国）。

1.2 模型制作 按照文献[3]方法制作PSNL模型，0.1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。备皮，无菌条件下切开大鼠右下肢皮肤，分离肌肉并暴露坐骨神经，在接近分叉处以8-0号线进行结扎4道，每两道相隔1.5 mm。强度以结扎后小腿肌肉轻颤为宜。冲洗伤口，缝合皮肤。术后第1 d痛阈下降30%，右下肢爪内收，并且轻度外翻和跛行，认为模型制作成功。

1.3 分组和给药 60只大鼠随机分为假手术组、模型组、MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组。MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组在造模后分别给予MGF 25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg灌胃给药，每日1次，连续治疗20 d。假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃处理。假手术组只分离出坐骨神经，不损伤神经。

1.4 热缩足反射潜伏期的测定 热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）的测定参照文献[3]方法，将大鼠放入透明有机玻璃笼内，利用光束射向大鼠下肢足底出现的抬足反射，记录时间。切断时间25 s，以防足底皮肤损伤，每隔5 min刺激1次，重复4次。

1.5 机械缩足反射阈值的测定 机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的测定，将大鼠置于透明有机玻璃箱中，底铁丝网格，适应20 min。采用冯弗伦电子测痛计，由底部往上垂直刺激大鼠右下肢足底皮肤，逐渐增加压力，读取测痛计右下肢回缩反应时的数值。每次刺激间隔20 s，重复4次。

1.6 Western blotting检测eNOS蛋白表达 20 d后将各组大鼠处死，取出右侧坐骨神经，充分研磨，3 mL/g蛋白裂解液充分裂解，以10 000 g离心40 min。BCA法测定总蛋白浓度，分别将各组蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，再分别进行转膜，封闭，一抗孵育过夜。二抗以1:10 000孵育2.5 h，加入显色剂显色，凝胶成像系统成像，Image J软件计算灰度值，内参GAPDH。

1.7 ELISA法检测氧化应激因子表达 20 d后将各组大鼠处死，取出右侧坐骨神经，充分研磨，稀释离心。利用ELISA法，标准稀释液进行稀释，按照Ellisa试剂盒说明书操作。加样结束，加终止液后混匀，设置450 nm波长酶标仪上进行检测，计算氧化应激因子NO含量和eNOS活性以及MDA、SOD、GSH和CAT含量。

2 结果

2.1 热缩足反射潜伏期变化 测定结果显示（见表1）：术后第1 d，模型组的TWL变化值明显低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组的TWL变化值与模型组比较无显著差异（P＞0.05）；术后第10 d和20 d，模型组的TWL变化值明显低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组的TWL变化值较模型组显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 MGF对大鼠TWL的影响（n=12,）

表1 MGF对大鼠TWL的影响（n=12,）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别nday 1day 10day 20假手术组（A）1213.1±1.213.6±1.313.7±1.3模型组（B）126.7±0.8a6.9±0.7a6.8±0.9a MGF 25 mg/kg组（C）126.8±0.67.7±0.9b7.9±0.8b MGF 50 mg/kg组（D）126.6±0.97.9±0.8b8.6±1.1b MGF 100 mg/kg组（E）126.8±1.18.5±1.0b8.9±0.9b t/P（B组与A组）t=1447.538/P=0.000t=1791.696 /P=0.000t=7141.500/P=0.000 t/P（C组与B组）t=1.6/P=0.275t=62.500 /P=0.001t=46.545/P=0.002 t/P（D组与B组）t=0.400/P=0.561t=96.100 /P=0.001t=486.000/P=0.000 t/P（E组与B组） t=1.600/P=0.275t=240.100 /P=0.001t=661.500/P=0.000 F/P（C、D、E组间）F=4.000/P=0.079F=0.060/P=0.943F=30.520/P=0.001

2.2 机械缩足反射阈值变化 测定结果显示（见表2）：术后第1 d，模型组的MWT变化值明显低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组的MWT变化值与模型组比较均无显著差异（P＞0.05）；术后第10 d和20 d，模型组的MWT变化值明显低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组的MWT变化值均较模型组显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 MGF对大鼠MWT的影响（n=12,）

表2 MGF对大鼠MWT的影响（n=12,）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别nday 1day 10day 20假手术组（A）1243.6±3.944.2±4.144.5±4.9模型组（B）1235.2±3.7a35.4±3.8a35.6±3.7a MGF 25 mg/kg组（C）1235.4±3.637.1±3.9b37.7±4.2b MGF 50 mg/kg组（D）1235.5±3.637.6±3.8b38.4±4.1b MGF 100 mg/kg组（E）1235.3±3.837.9±4.2b39.6±4.7b t/P（B组与A组）t=2646.000/P=0.000t=116.160 /P=0.000t=118.815/P=0.000 t/P（C组与B组）t=1.500/P=0.288t=8.670 /P=0.042t=6.615 /P=0.041 t/P（D组与B组）t=3.375/P=0.140t=7.260 /P=0.041t=11.760 /P=0.027 t/P（E组与B组） t=0.600/P=0.482t=8.678 /P=0.042t=24.000/P=0.008 F/P（C、D、E组间）F=1.000/P=0.422F=0.439/P=0.664F=2.770/P=0.141

2.3 大鼠MDA、SOD、GSH及CAT表达 测定结果显示（见表3）：模型组的MDA含量显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组的MDA含量均显著低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且模型组的SOD、GSH及CAT含量均显著低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组的SOD、GSH及CAT含量均显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 NO及eNOS变化 ELISA结果显示（见表4），模型组的NO含量和eNOS活性均显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组的NO含量和eNOS活性均明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blotting结果显示（见图1），模型组的eNOS蛋白表达显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MGF 25 mg/kg组、MGF 50 mg/kg组和MGF 100 mg/kg组的eNOS蛋白表达均明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 MGF对各组大鼠MDA、SOD、GSH及CAT表达的影响（n=12，）

表3 MGF对各组大鼠MDA、SOD、GSH及CAT表达的影响（n=12，）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别NMDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg prot)GSH(U/mg prot)CAT(U/mg prot)假手术组（A）1215.8±1.9179.3±12.621.7±1.651.8±2.1模型组（B）1249.6±2.3a32.5±8.7a4.2±1.2a9.2±1.9a MGF 25 mg/kg组（C）1231.8±2.5b59.3±11.1b6.8±0.9b16.3±2.3#MGF 50 mg/kg组（D）1223.9±3.1b78.2±10.4b7.5±1.1b22.7±1.8b MGF 100 mg/kg组（E）1219.6±2.2b112.3±11.9b9.8±1.3b30.7±2.1b t/P（B组与A组）t=1713.660/P=0.000t=32325.360 /P=0.000t=459.375/P=0.000t=2722.140/P=0.000 t/P（C组与B组）t=475.260/P=0.000t=1077.360/P=0.000t=10.140 /P=0.033t=75.615 /P=0.001 t/P（D组与B组）t=990.735/P=0.000t=3132.735 /P=0.000t=16.335/P=0.016t=273.375 /P=0.000 t/P（E组与B组） t=1350.000/P=0.000t=9552.060/P=0.000t=47.040/P=0.002t=693.375/P=0.000 F/P（C、D、E组间）F=114.870/P=0.000F=2164.510/P=0.000F=7.390/P=0.024F=156.160/P=0.000

表4 MGF对各组大鼠NO含量及eNOS活性的影响（n=12，）

表4 MGF对各组大鼠NO含量及eNOS活性的影响（n=12，）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别nNO (ng/mg prot)eNOS (μmol/g prot)假手术组（A）1214.6±2.546.8±5.2模型组（B）1258.9±4.3a148.2±6.9a MGF 25 mg/kg组（C）1240.2±3.9b105.7±5.3b MGF 50 mg/kg组（D）1233.6±3.4b89.3±4.7b MGF 100 mg/kg组（E）1229.9±3.1b80.2±5.1b t/P（B组与A组）t=2943.735/P=0.000t=15422.940 /P=0.000 t/P（C组与B组）t=524.535/P=0.000t=2709.375 /P=0.000 t/P（D组与B组）t=960.135/P=0.000t=5203.815 /P=0.000 t/P（E组与B组） t=1261.500/P=0.000t=6936.000 /P=0.000 F/P（C、D、E组间）F=81.670/P=0.000F=501.010/P=0.000

图1 Western blotting检测eNOS蛋白表达

3 讨论

PSNL模型是一种经典疼痛模型，其疼痛的特征与临床病理性疼痛相符，可产生明显的热痛觉过敏和机械异常性疼痛，其机制为外周神经损伤和炎症反应诱发的神经病理性改变[4]。本实验通过结扎大鼠右侧坐骨神经建立经典的神经病理性疼痛模型，连续7 d灌胃MGF处理大鼠，于PSNL诱发后神经病理性疼痛可显著缓解，明显增加热缩足反射潜伏期和机械痛阈值。并且高浓度MGF的治疗效果明显优于低、中浓度组，提示MGF对于神经病理性疼痛具有抑制作用。

近年来随着研究的深入，人们发现PSNL模型中氧化应激因子、炎性因子以及相关趋化因子在神经性病理性疼痛的发展和维持中起重要作用[5]。MDA是脂质氧化的最终产物，因此，MDA含量可直接反映体内氧自由基产生和释放水平，其表达的高低可间接反映细胞受自由基攻击的程度[6]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是细胞内主要的抗氧化酶，也是细胞内主要的自由基清除剂，可保护细胞对抗氧自由基对机体的损害，SOD水平的高低，可反映出内源性氧自由基清除系统功能[7]。过氧化氢酶（catalase，CAT）是一种酶类清除剂，存在于细胞的过氧化物体内。小胶质细胞是神经系统（central nervous system，CNS）主要的免疫细胞，当CNS受到损伤、炎症、缺血等刺激时，小胶质细胞被激活，表现在细胞形态突起回缩，细胞大量增殖，并释放大量生物活性因子，进行免疫应答反应[8]。此外，小胶质细胞的激活还可诱发其他生理和功能学改变，如细胞分化、吞噬、迁移，释放细胞因子MDA、SOD、GSH、CAT、NO以及脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等，促进炎症反应进程以及诱导疼痛的发生和维持[9]。再次，活化的小胶质细胞还可趋化其他细胞炎症介质，通过细胞表面Toll-like受体介导IL-18和IL-1β的分泌[10]。已有大量研究证实，外周氧化应激反应激活小胶质细胞有诱发痛觉过敏作用[11]。此外，PSNL模型中星形胶质细胞被激活后，细胞的生理和功能发生改变，首先胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）大量表达，进而诱导和释放MDA、SOD、GSH、CAT、NO以及eNOS产生[12-13]。INCB-3344是MCP-1特异性拮抗剂。有研究显示，通过鞘内注射INCB-3344，可缓解由MCP-1诱导形成的痛觉过敏[14-15]。本实验通过研究发现，MGF能显著抑制PSNL模型鼠坐骨神经中NO含量和eNOS活性，以及氧化应激因子MDA、SOD、GSH、CAT含量，提示MGF可通过抑制氧化应激反应对神经性疼痛产生保护作用。然而，信号通路是细胞代谢过程中复杂多样的网络系统，MGF通过哪些信号通路发挥调节作用仍需进一步研究。

MGF能有效抑制PSNL大鼠热痛敏和机械性痛敏，并且在镇痛效果上呈剂量依赖性，其相关分子机制可能与抑制氧化应激反应相关。

[1] Nishinaka T, Nakamoto K, Tokuyama S.Early life stress induces sex-dependent increases in phosphorylated extracellular signalregulated kinase in brains of mice with neuropathic pain [J].Eur J Pain, 2016, 20(8): 1346-1356.

[2] Vyas A, Syeda K, Ahmad A, et al.Perspectives on medicinal properties of mangiferin [J].Mini Rev Med Chem, 2012, 12(5):412-425.

[3] Deng C, Gu YJ, Zhang H, et al.Estrogen affects neuropathic pain through upregulating N-methyl-D-aspartate acid receptor 1 expression in the dorsal root ganglion of rats [J].Neural Regen Res, 2017, 12(3): 464-469.

[4] Wu YE, Li YD, Luo YJ, et al.Gelsemine alleviates both neuropathic pain and sleep disturbance in partial sciatic nerve ligation mice [J].Acta Pharmacol Sin, 2015, 36(11): 1308-1317.

[5] Sharma M, Garigipati S, Kundu B, et al.Discovery of novel 1,2,4-triazol-5-ones as tumor necrosis factor-alpha inhibitors for the treatment of neuropathic pain [J].Chem Biol Drug Des, 2012,80(6): 961-970.

[6] Zakaria MMH, Hajipour B, Estakhri R, et al.Anti-oxidative effect of resveratrol on aluminum induced toxicity in rat cerebral tissue[J].Bratisl Lek Listy, 2017, 118(5): 269-272.

[7] Afonso V, Champy R, Mitrovic D, et al.Reactive oxygen species and superoxide dismutases: Role in joint diseases [J].Joint Bone Spine, 2007, 74(4): 324-329.

[8] Bellesi M, de Vivo L, Chini M, et al.Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex [J].J Neurosci, 2017, 37(21): 5263-5273.

[9] Zheng J, Jiang YY, Xu LC, et al.Adult Hippocampal Neurogenesis along the Dorsoventral Axis Contributes Differentially to Environmental Enrichment Combined with Voluntary Exercise in Alleviating Chronic Inflammatory Pain in Mice [J].J Neurosci,2017, 37(15): 4145-4157.

[10] Strackx E, Sparnaaij MA, Vlassaks E, et al.Lipopolysaccharideinduced chorioamnionitis causes acute inflammatory changes in the ovine central nervous system [J].CNS Neurol Disord Drug Targets, 2015, 14(1): 77-84.

[11] Ekmark-Lewén S, Flygt J, Fridgeirsdottir GA, et al.Diffuse traumatic axonal injury in mice induces complex behavioural alterations that are normalized by neutralization of interleukin-1β [J].Eur J Neurosci, 2016, 43(8): 1016-1033.

[12] Kim SK, Hayashi H, Ishikawa T, et al.Cortical astrocytes rewire somatosensory cortical circuits for peripheral neuropathic pain [J].J Clin Invest, 2016, 126(5): 1983-1997.

[13] McFerrin J, Patton BL, Sunderhaus ER, et al.NTE/PNPLA6 is expressed in mature Schwann cells and is required for glial ensheathment of Remak fibers [J].Glia, 2017, 65(5): 804-816.

[14] Rancan L, Paredes SD, Huerta L, et al.Chemokine Involvement in Lung Injury Secondary to Ischaemia/Reperfusion [J].Lung,2017, 195(3): 333-340.

[15] Bulanov NM, Serova AG, Kuznetsova EI, et al.Kidney injury molecules (KIM-1, MCP-1) and type IV collagen in the assessment of activity of antineutrophil cytoplasmic antibodyassociated glomerulonephritis [J].Ter Arkh, 2017, 89(6): 48-55.