曹阳 熊雪丰 肖昌钱

浙江医院 浙江 杭州 310013

海马神经元具备中枢神经元的典型特征。通过模拟相关疾病发病机制，建立体外海马细胞病理模型，进行神经药物的筛选及药效机制研究是目前常用的药理研究手段[1]。中医学认为，人参具有安神益智之功效，故临床常用于神经衰弱等中枢性神经疾病的治疗。人参皂苷是人参的主要活性成分，有广泛的药理作用[2]，常用的有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rbl三种。目前未见海马神经细胞对人参中不同人参皂苷的吸收及利用程度相关报道。本文对三种常用人参皂苷在海马细胞内外含量进行比较，从细胞内外药物浓度变化的角度阐述不同人参皂苷对海马细胞的作用差异，为临床上使用人参治疗相关神经性疾病提供一定的科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器：Thermo Ultimate 3000 HPLC高效液相色谱系统、高压泵、CAD（Charged Aerosol Detector）检测器、Thermo Ultimate 3000 colcumn compartment柱温箱、Chromeleon 7数据处理器（Thermo Fisher Scientific company）；Anke TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；KUDOS SKF-6A超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Capcell C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；AT201型电子天平（梅特勒-托利多上海仪器有限公司）；311型二氧化碳细胞培养箱（Thermo Scientific，USA）；ECLIPSE Ti型倒置荧光显微镜（Nikon，Japan）。

1.2 对照品：人参皂苷Rg1（批号110703-201426）、人参皂苷Re（批号110754-201422）、人参皂苷Rb1（批号110704-201420）购自中国食品药品检定研究院，含量均≥98%。

1.3 试剂：DMEM高糖培养基、D-Hank’s缓冲液（Hyclone公司）；Neuralbasal培养基、B27、胎牛血清（Gibco公司）；青霉素和链霉素（Sigma公司）；谷氨酰胺、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶、细胞裂解液（杭州昊天生物技术有限公司）；甲醇和乙腈（色谱级，Merck公司），水为纯净水，其它试剂均为分析纯。

1.4 动物：SPF级新生SD大鼠，雄性，体重10±2g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK（浙）2008-0033。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：色谱柱-Capcell C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），采用两相梯度洗脱：0～10min，A为19%；10～40min，A为19%～25%；40～45min，A为25%～31%；45～60min，A为31%～37%；检测波长：205nm；流速：1ml/min；柱温：25℃，进样体积：20μl。在该系统条件下各峰分离度良好，理论塔板数均大于3000。

2.2 对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品2.124mg，人参皂苷Re对照品2.045mg和人参皂苷Rb1对照品2.087mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成含人参皂苷Rg1、Re和Rb1分别为212.4mg/L、204.5mg/L和208.7mg/L的混合对照品溶液。

2.3 细胞内、外液样品的分组和制备：取新生SD大鼠，采用原代培养法分离海马细胞[3]。将细胞悬液种植于6孔板中，置于37℃、5%CO2条件下进行培养，24h后全量换维持培养基，以后隔天半量换液。1周左右待海马细胞生长至70%～80%，加入各含100.0mg/L的三种人参皂苷混合对照品培养液继续培养，24h后用PBS充分冲洗细胞，并用细胞刮刀收集细胞于1.5ml离心管，3000r/min离心5min，弃上清液，加细胞裂解液溶解细胞，再次离心后取上清液，得细胞内液。分别取1ml细胞内外液，置于5ml离心管中，加1.5ml乙酸乙酯，涡旋振荡混匀，经50000r/min离心10min，取上清液转移至1.5ml离心管中，挥干溶剂，用100μl甲醇重溶，再次50000r/min离心10min，取上清液分别作为细胞内外供试品溶液。

2.4 方法学验证：分述如下。

2.4.1 线性关系考察：精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0ml，用甲醇稀释定容到10ml，分别进样20μl。以对照品人参皂苷Rg1、Re和Rb1的质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，得3个线性回归方程，见表1。结果表明人参皂苷Rg1、Re和Rb1在线性范围内呈良好的线性关系。

表1 三种人参皂苷线性范围及检出限

2.4.2 精密度试验：取“2.2”项下混合对照品溶液重复进样5次，结果显示，人参皂苷Rg1、Re和Rb1的日内RSD分别为1.71%、1.33%、1.47%，表明精密度良好。

2.4.3 稳定性试验：取“2.3”项下同一供试品溶液，室温放置，分别于1、2、4、8、12、24h取样20μl，按“2.1”项下条件测定。结果显示，人参皂苷Rg1、Re和Rb1的RSD分别为2.24%、1.16%、2.12%，表明在24h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验：取“2.3”项下同一细胞供试品溶液各3份，同法制备供试品溶液并测定含量。结果显示，人参皂苷Rg1、Re和Rb1的RSD分别为0.45%、0.59%、0.67%，表明该方法重复性较好。

2.4.5 加样回收率试验：取“2.3”项下已知三种人参皂苷含量的细胞供试品溶液9份，按照高、中、低比例，加入适量对照品溶液，按“2.3”项下同法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果显示，人参皂苷Rg1、Re和Rb1平均回收率分别为98.32%、98.47%和96.74%，RSD分别为2.18%、3.05%、3.34%。

2.5 样品含量测定：分别收集加入含药培养液后0、1、2、4、8、24h时的细胞外培养液和细胞内液各1ml，按“2.3”项下方法制备，分别进样20μl，按“2.1”项下色谱条件测定其含量，结果见图1，表2。

图1 海马细胞胞外药物含量-时间曲线（n=3）

表2 海马细胞对三种人参皂苷的吸收利用比较结果（n=3）

3 讨论

人参是传统的补益中药，可加强大脑皮层的兴奋和抑制过程，调节两者平衡，降低大脑兴奋过程的疲惫性，提高记忆力，具有安神益智之功效。其主要成分人参皂苷具有相似的基本结构，都含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核，其药理作用类似，但药效作用也各有侧重。本实验建立的海马神经细胞内外液中同时检测人参皂苷Rg1、Rb1和Re的方法简便、灵敏，经过方法学验证，其准确度、精密度和回收率上都达到了生物分析的要求。图1和表2显示，细胞外液中三种人参皂苷的含量均在2h内显著降低，而在2～24h之间含量变化不大，说明三种人参皂苷基本在2h内被海马细胞吸收饱和。24h时海马神经细胞对人参皂苷Rg1、Re和Rb1的平均吸收率分别为9.55%、13.76和80.3%。通过测定培养24h后胞内残留的药物含量，人参皂苷Rg1、Re和Rb1的转化率分别为83.56%、80.23%和88.66%。表明在相同培养条件下，海马神经细胞对三种人参皂苷的吸收和转化利用各有差异，吸收率依次为：人参皂苷Re＞人参皂苷Rg1＞人参皂苷Rb1，转化利用率依次为：人参皂苷Rb1＞人参皂苷Rg1＞人参皂苷Re。这可能与三种人参皂苷成分分子量大小和结构存在差异有关：分子量较小和亲脂性强的药物更容易进入细胞，而细胞对药物的转化也有优先选择效应。

实验表明，海马细胞对不同种类人参皂苷的生物代谢存在差别，为人参皂苷在临床上中枢神经性疾病的防治提供了科学依据。

[1]黄孝闻，王绪平，寿旦.海马神经元细胞模型及其应用的研究进展[J].中华中医药学刊，2015，33（11）：2730-2733.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：8-9.

[3]孙琪，徐志伟，敖海清，等.大鼠海马神经细胞体外原代培养与鉴定[J].中药新药与临床药理，2010，21（5）：461-464.