冯月娟王灿灿童岳阳郁东伟施凯徐永芳黄旭晴王建峰徐婷吕玉宝徐长青#

1 杭州师范大学附属医院 浙江 杭州 310015

2 复旦大学附属华山医院 上海 020040

笔者在前期实验研究显示补肾健脾益气方通过抑制瘦素及瘦素受体改善实验性慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠免疫炎症反应，为进一步揭示该方延缓因COPD导致的骨骼肌丢失的分子生物学机制，进行实验。报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂：大鼠血清瘦素、瘦素受体、TNF-α和IL-6试剂盒购于上海西塘生物科技有限公司；大鼠骨骼肌瘦素及瘦素受体Real-time PCR试剂盒购于宝生物工程有限公司；大鼠骨骼肌瘦素及瘦素受体Westernblot相关试剂盒购于宝生物工程有限公司。

1.2 分组与动物模型建立：健康纯系SD雄性大鼠60只，体质量120±20g，按体质量层次随机抽取15只为正常对照组，基础饲料喂养，连续12周，余下45只作为慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）模型组和补肾健脾益气方组（高剂量组和低剂量组），利用经典熏香烟方案[1]制作大鼠COPD模型。模型组基础饲料喂养，补肾健脾益气方组中药灌胃，每天1次（根据实验动物用药剂量换算表，将人的补肾健脾益气方临床剂量换算成大鼠的剂量，分为高剂量和低剂量组，高剂量为原有成人剂量的2倍）。模型组乙醚麻醉，处死取血及后腿骨骼肌，利用小动物呼吸机验证造模成功。

1.3 用药方案：补肾健脾益气方，本院制剂室提供，组成：仙灵脾、黄芪各30g，仙茅15g，党参、白术、茯苓、怀山药各10g，补骨脂、山萸肉、柴胡各12g，甘草6g。可酌情增加紫苏、熟地、地龙各12g，麦冬、丹参各15g，川贝5g，五味子9g。根据实验动物用药剂量换算表[2]，将人的补肾健脾益气方临床剂量换算成大鼠的剂量，浓缩成2ml药物,模型组及复方治疗高剂量组和低剂量组每日灌胃1次，连续灌胃12周。

1.4 指标检测：采用ELISA试剂盒检测大鼠血清瘦素、瘦素受体、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）水平；Real-timePCR检测补肾健脾益气方干预慢阻肺大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受体mRNA水平；Western blot法检测慢阻肺大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受体蛋白表达。

1.5 统计学方法：统计软件采用SPSS 18.0版，计量资料以±s表示，组间统计采用单因素方差分析，P＜0.05为统计有差异的标准。

2 结果

2.1 各组血清瘦素、瘦素受体水平比较：见表1。

表1 各组血清瘦素、瘦素受体水平（ng/ml）

2.2 各组血清TNF-α和IL-6水平比较：见表2。

表2 各组血清TNF-α和IL-6水平（ng/ml）

2.3 各组骨骼肌瘦素及其受体mRNA表达比较：见表3。

表3 各组骨骼肌瘦素和瘦素受体mRNA表达

2.4 各组大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受体蛋白表达比较：

Western blot检测报告提示，与正常对照组（光密度值：1426.854）相比较，大鼠慢阻肺模型组（光密度值：149932.163）骨骼肌瘦素和瘦素受体蛋白表达有所增加（光密度值分别与内参GAPDH比较）。与慢阻肺模型组比较，高剂量组和低剂量组瘦素表达水平有所降低。就骨骼肌瘦素而言，高剂量组光密度值（光密度值：91822.987）较慢阻肺模型组光密度值下降更明显，提示高剂量组有更强的抑制慢阻肺模型瘦素水平的作用。就骨骼肌瘦素受体而言，与慢阻肺模型组比较，高剂量组（光密度值：73501.658）比低剂量组瘦素受体表达水平下降明显。

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病稳定期多属本虚为主，标实为次，肺、脾、肾三脏虚损是COPD发生发展及反复发作的内在条件，“脾为肺之母”，脾虚日久必然损伤气血津液等精微物质化生不足，四肢骨骼肌肉失于濡养，最终导致肌肉萎缩及功能障碍。COPD肌肉萎缩、肌肉乏力和疲劳症状属于中医学“痿症”“痿蹩。中医学认为，脾在体合肉，主四肢，全身的肌肉四肢，都有赖于脾胃运化的水谷精微及津液的营养滋润，才能壮实丰满，活动灵活有力，故强调健脾的治疗。所用方中，仙灵脾、仙茅补肝肾之不足，温壮元阳、温肾助阳纳气；补骨脂补肾温脾阳；山萸肉滋肾；党参、白术、茯苓、怀山药、炙甘草健脾补中，益气健脾化痰以堵生痰之源，培土生金，且扶土上可荫肺，下可制水，实为治本之法；黄芪补气升阳，益气固表；北柴胡升举脾气，使气血得予输布经脉五脏。

表1结果表明，与正常组比较，复方治疗高剂量组和低剂量组血清瘦素水平增加程度较血清瘦素受体水平更加明显，可能机制是补肾健脾益气方具有其他作用机理可以不经过瘦素受体通路降低血清中瘦素水平，其具体机制有待进一步研究。

慢阻肺特征性病理生理改变是气道、肺实质及肺血管的慢性炎症性病变，炎症细胞释放的炎症因子和炎症趋化因子在慢阻肺的炎症反应及免疫应答中起重要作用。表2结果表明，提示补肾健脾益气方高剂量组具有明显的抑制外周血炎症反应的作用，究其原因可能因本复方中主要药物淫羊藿具有抑制炎症反应，抑制核转录因子（NF-κb）有关，这个结果与淫羊藿单体淫羊藿苷相关研究结果相一致[3-4]。

为进一步明确补肾健脾益气方降低血清中瘦素瘦素受体的可能机制，笔者采用Real-time PCR检测各组大鼠后腿骨骼肌中瘦素及瘦素受体mRNA表达。表3结果显示：与正常组比较，大鼠慢阻肺模型组骨骼肌瘦素和瘦素受体mRNA表达有所升高（P＜0.01），提示慢性炎症浸润可以增加瘦素及瘦素受体的表达。与慢阻肺模型组相比较，复方治疗高剂量组和低剂量组骨骼肌瘦素和骨骼肌瘦素受体吸光度均降低，但复方治疗高剂量组降低更加明显（P＜0.01），提示复方治疗组可以降低骨骼肌瘦素mRNA表达。

笔者为深入研究，采用Western blot检测各组大鼠后腿骨骼肌瘦素及瘦素受体表达，实验结果提示，与正常组（光密度值：1426.854）比较，大鼠慢阻肺模型组（光密度值：149932.163）骨骼肌瘦素和瘦素受体蛋白表达有所增加（光密度值分别与内参GAPDH比较）。与模型组比较，高剂量组和低剂量组瘦素表达水平有所降低。就骨骼肌瘦素而言，高剂量组光密度值（光密度值：91822.987）较模型组下降更明显，提示复高剂量组有更强的抑制慢阻肺模型瘦素水平的作用。就骨骼肌瘦素受体而言，与模型组比较，高剂量组（光密度值：73501.658）比低剂量组瘦素受体表达水平下降明显。

骨骼肌功能障碍作为慢阻肺的主要肺外表现，是评估慢阻肺预后的重要标准之一，慢阻肺患者存在肺肾气虚、肺脾气虚[5]，既可造成骨骼肌能量供需障碍，同时也会导致其内在结构的变化，使得患者的呼吸肌萎软失用，不耐疲劳，致肺失清宣，而成气逆喘咳。因此补肾健脾益气使脾气得健，有利于加强肌肉的营养，减少呼吸肌蛋白的分解，改善骨骼肌能源物质的供给，从而增强呼吸肌收缩力及耐力，减轻呼吸肌疲劳，减轻气促等不适症状，提高生活质量。本实验以补肾健脾益气为法，按照随机对照的原则对大鼠慢阻肺模型进行研究，尝试评价补肾健脾益气对于改善慢阻肺的呼吸肌疲劳、抗炎和调节免疫等方面的疗效，为临床治疗慢性阻塞性肺疾病提供科学而客观的实验研究资料。

[1]林江涛,翁心植.慢性阻塞性肺疾病与肺源性心脏病[M].北京：北京出版社，1999：366-381.

[2]宋小莲,王昌惠,白冲.脂多糖结合熏烟法和单纯熏烟法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比较[J].第二军医大学学报,2010,31(3)：246-249.

[3]Xu CQ,Liu BJ,Wu JF,et al.Icariin attenuates LPS-inducedacute in flammatory responses：involvement of PI3K/Akt and NF-kappaB signaling pathway[J].Eur J Pharmacol.2010，642(1-3)：146-153.

[4]吴金峰,董竞成,徐长青,等.淫羊藿苷拮抗脂多糖炎症模型的体内和体外研究[J].中国中西医结合杂志，2009，29(4)：330-334.

[5]中华中医药学会内科分会肺系病专业委员会.慢性阻塞性肺疾病中医证候诊断标准(2011版)[J].中医杂志，2012,53(2)：177-178.