沈建君 张睿 高倩倩 付敏军 郑红斌

浙江中医药大学基础医学院 浙江 杭州 310053

麦纤散是郑红斌教授运用麦芽纤维防治溃疡性结肠炎（UC）这一访日留学研究成果，结合临床经验配伍而成。本实验旨在探讨在此基础上酌加白及组成的新麦纤散对UC大鼠结肠黏膜炎症及血清白介素（IL）-34、IL-35的影响。

1 材料

1.1 动物：60只SD大鼠，雄性，体质量200±20g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2013-0016，饲养于浙江中医药大学动物实验中心，常规饲料进食，保证环境清洁、通风。

1.2 药物：美沙拉嗪缓释颗粒（上海爱的发制药有限公司，批号：H20143164），于研钵中捣碎，加蒸馏水配成一定浓度的混悬液，4℃保存备用。精选优质发芽大麦，经去糖化、烘干、碾碎、碱-酶结合法提取麦芽纤维。将购于浙江中医药大学中医门诊部的优质茯苓、白及、山药、马齿苋、三七制成超细粉末，过120目标准筛，按照一定比例与麦芽纤维充分混匀制成新麦纤散，加蒸馏水配成一定浓度的混悬液，4℃保存备用。

1.3 试剂：DSS（美国MP公司，货号：0216011080，分子量36000-50000）；IL-34ELISA测试盒[96T，货号：CKE95265R，艾莱萨生物科技(上海)有限公司]；IL-35 ELISA测试盒[96T，货号：CK-E93202R，艾莱萨生物科技(上海)有限公司]；深蓝大便隐血检测试剂盒（安徽深蓝医疗科技股份有限公司，批号：20152400174）。

2 方法

2.1 分组及造模：60只雄性SD大鼠按每组10只，随机分为正常组，模型组，美沙拉嗪组，新麦纤散低、中、高剂量组。用蒸馏水配成5%DSS溶液予大鼠自由饮用，每日更换，连续7天，正常组则饮用纯净水。当造模大鼠出现明显的腹泻、黏液脓血便等症状时，说明UC模型成功复制。

2.2 给药：UC模型诱导成功后第二天给予相应药物治疗。根据大鼠与人体每公斤体重剂量折算系数为6.25，美沙拉嗪缓释颗粒临床成人急性发病期适宜摄入量为4g/d，美沙拉嗪组给予美沙拉嗪缓释颗粒混悬液0.42g/kg每日灌胃；新麦纤散临床成人急性发病期适宜摄入量为5g/d，以其3、6、12倍用量，新麦纤散低、中、高剂量组分别给予新麦纤散混悬液1.5、3、6g/kg每日灌胃；其余组大鼠予等体积生理盐水灌胃，连续治疗2周。

2.3 标本采集：末次给药24h后，称量大鼠体重，观察大鼠粪便性状，并收集至10ml试管中，按照深蓝大便隐血检测试剂盒说明书进行血便检测；腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，充分暴露腹主动脉，用10ml的注射器采血，1000r/s离心5min后，小心吸取血清分装到1.5ml无菌EP管中，-20℃保存备用；肉眼观察结肠组织，切取病变严重部位，置于10%福尔马林溶液中固定，用于病理切片制作。

2.4 观察指标与检测方法：分述如下。

2.4.1 疾病活动指数（DAI）评分：称量大鼠体重，肉眼观察大鼠粪便性状、血便症状，利用公式“疾病活动指数=(体重评分+粪便性状评分+隐血评分)/3”给大鼠做DAI评分。0分：体重无下降，大便正常，大便隐血正常；1分：体重下降1%～5%，大便松散，大便隐血阳性；2分：体重下降5%～10%，大便松散，大便隐血阳性；3分：体重下降10%～15%，稀便，肉眼血便；4分：体重下降＞15%，稀便，肉眼血便[1]。

2.4.2 组织病理切片观察及评分：取大小约为2.0cm×1.0cm×0.3cm的结肠标本，梯度脱水后，石蜡包埋、切片、HE染色后，观察并评估各组结肠组织的病理变化。评分标准：0分：无上皮损伤和溃疡形成；1分：糜烂，溃疡深度和浸润程度在黏膜下层，轻度水肿和炎性细胞浸润；2分：溃疡深度和浸润程度在肌层，中度水肿和炎性细胞浸润；3分：溃疡深度和浸润程度在浆膜层，重度水肿和炎性细胞浸润。

2.4.3 ELISA法检测大鼠血清IL-34、IL-35水平：IL-34、IL-35ELISA测试盒置于室温20min后，在标准品孔加不同浓度的标准品50μl，样品孔分别加入待测样本、样本稀释液，然后分别加入抗体、显色剂A和B后，37℃避光孵育15min，再加入终止液50μl，在450nm波长处测定各孔的OD值，参照标准品线性曲线计算各样本的表达水平。

2.5 统计学方法：采用SPSS18.0统计软件处理数据，结果用±s表示；各组结果使用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况观察与DAI评分比较：正常组大鼠饮食照常，体重增加，粪便成形，无明显不适症状。饮用DSS溶液后，多数老鼠第二天腹泻严重、便溏、体重减轻，三四天后有血便症状、精神不振、毛发光泽差，五六天后情况加重，肛周大片秽物黏附、有明显脓血便。新麦纤散治疗后大鼠血便改善，粪便逐渐成形，体重也有所增加。DAI评分见表1。

3.2 各组结肠组织病理切片观察及病理损伤评分比较：正常组大鼠结肠黏膜完整，未见溃疡、水肿，也无炎症细胞浸润，模型组大鼠结肠黏膜明显充血水肿、溃疡形成，杯状细胞畸形、减少，腺体排列不规则，淋巴细胞等炎症细胞浸润明显。新麦纤散低中高剂量组结肠黏膜有不同程度的缺失，少见溃疡、中性粒细胞等炎症细胞浸润，腺体排列较规则。见图1、表1。

图1 各组大鼠结肠组织病理切片（200×）

3.3 各组血清IL-34、IL-35水平变化比较：见表1。

表1 各组大鼠DAI评分、结肠病理损伤评分及血清IL-34、IL-35水平比较（±s）

表1 各组大鼠DAI评分、结肠病理损伤评分及血清IL-34、IL-35水平比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

正常组模型组美沙拉嗪组新麦纤散低剂量组新麦纤散中剂量组新麦纤散高剂量组50.69±5.85 24.33±4.09*40.52±2.88#31.76±2.18#36.27±2.16#34.71±1.51#10 9 10 10 10 10 0.00±0.00 3.51±0.18*0.53±0.32#0.73±0.43#0.57±0.32#0.60±0.31#0.00±0.00 2.33±0.50*0.60±0.21#0.90±0.46#0.65±0.24#0.70±0.26#47.58±7.02 97.04±8.30*59.80±5.56#79.66±4.13#70.63±3.03#71.53±2.29#

4 讨论

UC是由多因素导致免疫功能紊乱而介导的慢性炎症性肠道疾病，病变主要涉及肠道黏膜及黏膜下层，可有淋巴细胞、浆细胞等细胞浸润，炎症贯穿于本病始终。中医学重视湿热邪气在UC发病中的作用，嗜食肥甘厚腻，脾胃斡旋不利，水谷不化，湿邪内生，郁久化热，下注肠道、灼伤肠络，日久引起本病的发生。新麦纤散正是针对此病因病机配伍而成，散剂中麦芽消食助运；茯苓、山药化湿和中，健脾固肠；马齿苋清肠解毒止痢；三七、白及止血排脓，化瘀敛疮。诸药共奏清肠解毒化湿、健脾厚肠敛疮之功。

研究表明，IL-34参与并加重UC的炎症反应[2]，IL-35则与UC的疾病活动度呈负相关[3]。本实验结果显示，在DSS诱导的UC大鼠模型中，血清IL-34呈现高表达，而IL-35的表达水平则显著降低。应用新麦纤散治疗后，血清IL-34水平降低，而IL-35水平升高，同时UC大鼠的DAI评分降低，结肠组织损伤减小，溃疡和炎症程度减轻，这表明新麦纤散可能通过抑制IL-34的分泌，上调IL-35的表达，起到抗炎愈溃作用，从而有效改善肠道黏膜炎症，对UC大鼠有较好的疗效。

[1]Sánchez-Fidalgo S，Cárdeno A，Sánchez-HidalgoM，et al.Dietary extra virgin olive oil polyphenols supplementation modulates DSS-induced chronic colitis in mice[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2013，24(7)：1401-1413.

[2]汪洋，邵建国，卞兆连，等．白细胞介素-34及其在炎症性肠病中的作用[J].国际消化病杂志，2016，36（5）：264-268.

[3]唐文静，王婷婷，汪良芝．IL-35在炎症性肠病中的表达及临床价值[J].中国医药生物技术，2016，11（2）：142-144.