张智慧 陈芝芸 叶蕾 严茂祥

浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310006

有研究证实，心、肾、肺等组织的局部肾素-血管紧张素系统(RAS)与该组织的纤维化密切相关[1-2]，其主要活性物质血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）主要通过1型受体（AT1）发挥作用。近年研究发现，肝脏组织中也存在着独立的RAS，而且在肝纤维化时异常激活，肝内AngⅡ与纤维化程度呈正相关[3-4]。笔者前期研究发现，从银杏科植物银杏的叶中分离纯化的银杏叶提取物(GbE)具有抗肝细胞损伤、抑制肝星状细胞的激活和转化，降低转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达，下调肝组织中能促进肝细胞凋亡的P21蛋白表达，减少胶原合成和沉积等作用，有效防止CCl4诱导大鼠肝纤维化的进展[5-6]。本研究旨在探讨GbE对四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化大鼠肝脏AngⅡ及其受体表达的影响，进一步阐述GbE抗肝纤维化的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠48只，体重190-210g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心SPF屏障系统中。

1.2 主要药物与试剂：GbE由西安中鑫生物技术有限公司提供，含24.03%的黄酮苷和6.15%的银杏内酯。CCl4为上海凌峰化学试剂有限公司产品。羟脯氨酸(Hyp)测试盒南京建成生物工程研究所；AngⅡ放免试剂盒为解放军总医院科技开发中心放免研究所产品；血管紧张素酶(ACE)ELISA试剂盒为美国ADL公司产品；Trizol为美国Invitrogen公司产品；反转录试剂盒和Perfect Real Time-SYBR Premix EX TaqTM试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；引物由上海英俊生物技术有限公司合成：AngⅡ上游引物：5'-AGC ACG GAC AGC ACC CTA TT-3'，下游引物：5'-AGA ACT CAT GGA GCC CAG TCA-3'，扩增片段：91bp；AT1上游引物：5'-TAT CAC AGT GTG CGC GTT TCA-3'，下游引物：5'-TGG TAA GGC CCA GCC CTA T-3'，扩增片段：68bp；β-actin上游引物：5’-TGT TGC CCT AGA CTT CTT CGA GCA-3’，下游引物：5’-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3’；扩增片段：112bp；BCA试剂盒、鼠抗α-Tubulin为碧云天生物技术研究所产品，鼠抗AT1单克隆抗体为美国Abcam公司产品；HRP标记羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG、化学发光显色试剂盒均为联科生物技术有限公司产品。

1.3 主要仪器：SN-695智能放射免疫γ测量仪为上海原子核研究所日环仪器厂产品，VITEK比色计为美国HACH公司产品，ABI 7500荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品，BIO-RAD图像分析、SD Semi-Dry型半干转印系统、MiniP3型垂直电泳槽均为美国BIO-RAD公司产品。

1.4 分组及处理：40只大鼠随机分成正常组、模型组、GbE高剂量组、GbE中剂量组、GbE低剂量组共5组，每组8只；模型组及各药物干预组以40%的CCl4（CCl4：橄榄油=2∶3）皮下注射，3ml·Kg-1·d-1，每周2次，首次加倍，连续6周，正常组每周2次以等容量橄榄油皮下注射，同时GbE高、中剂量组、低剂量组每天以200、100、50mg·Kg-1·d-1的GbE灌胃；正常组和模型组每天灌服等容量的蒸馏水，均干预6周；末次给药当晚各大鼠禁食不禁水，次日空腹麻醉下取血和肝组织，部分肝组织中性甲醛固定，另外存-80℃冰箱待用。

1.5 检测方法：肝脏中Hyp含量采用碱水解法检测。肝组织病理采用常规石蜡包埋，Masson胶原染色，光镜观察，肝纤维化程度分级标准[7]：0级为无肝纤维化；1级为轻度，纤维沉积仅位于小叶中央；2级为中度，纤维沉积扩展至小叶中央之外，但未至小叶边缘；3级为重度，纤维沉积扩展至小叶边缘；4级为早期肝硬化（定性标准）。血浆AngⅡ水平采用放免法检测，血浆ACE水平采用ELISA法检测。以Trizol抽提肝组织中总RNA，反转录试剂盒合成cDNA第一链，采用Realtime-PCR法检测AngⅡ及其受体AT1mRNA表达，β-actin为内参，相对表达量(2-△△Ct)来表示目的基因AngⅡ和AT1mRNA的表达水平。以RIPA组织裂解液对肝组织匀浆提取总蛋白，Western blot法检测AT1蛋白表达，X线胶片曝光显影，BIO-RAD图像分析系统进行吸光度扫描，以α-Tubulin为内参，相对表达量表示AT1蛋白表达的水平。

1.6 统计学分析方法：采用SPSS11.5软件统计，数据用均数±标准差(±s)表示，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料转换成正态分布后再进行单因素方差分析；等级资料采用非参考秩和检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 GbE对肝纤维化大鼠肝组织纤维化程度的影响：模型组大鼠肝组织Hyp水平较正常组均明显增高（P＜0.01），GbE高、中、低剂量组Hyp水平较模型组明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 GbE对大鼠肝组织Hyp水平的影响(±s)

表1 GbE对大鼠肝组织Hyp水平的影响(±s)

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01。

肝组织Hyp(ug/mg湿重)217.75±48.8 410.25±91.83**304.37±32.14**ΔΔ 335.37±32.14**Δ 344.50±40.10**Δ分组正常组模型组GbE高剂量组GbE中剂量组GbE低剂量组只数88888

2.2 GbE对肝纤维化大鼠肝组织纤维化程度的影响：

Masson胶原染色显示，正常组大鼠肝组织结构较完整，仅少量血管壁有蓝色胶原着色；模型组大鼠肝组织有大量着蓝色胶原纤维沉积，纤维间隔较宽，伴大量的脂肪空泡。GbE各剂量组蓝色胶原纤维沉积较模型组大鼠减少，纤维间隔也较较模型组大鼠变窄，且脂肪空泡减少（P＜0.05，P＜0.01）。经过统计，各组大鼠肝纤维化分级情况见表2。

表2 GbE对大鼠肝组织纤维化程度的影响(例)

2.3 GbE对大鼠血浆AngⅡ、ACE水平的影响：模型组大鼠血浆AngⅡ、ACE水平较正常组均明显增高（P＜0.01），GbE高、中、低剂量组大鼠血浆AngⅡ、ACE水平较模型组不同程度明显降低（P＜0.05；P＜0.01），见表3。

表3 GbE对大鼠肝组织Hyp及血浆AngⅡ、ACE水平的影响(±s)

表3 GbE对大鼠肝组织Hyp及血浆AngⅡ、ACE水平的影响(±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01。

25.88±4.50 39.08±4.74**30.16±6.95ΔΔ 32.23±6.19*Δ 33.26±3.99**Δ正常组模型组GbE高剂量组GbE中剂量组GbE低剂量组88888 65.02±28.06 152.16±40.51**81.89±26.31ΔΔ 83.27±26.47ΔΔ 94.06±21.23ΔΔ

2.4 GbE对大鼠肝组织AngⅡ及其受体表达的影响：模型组大鼠肝组织AngⅡmRNA、AT1mRNA及蛋白表达水平显著高于正常组(P＜0.01)；GbE高、中、低剂量组大鼠肝组织AngⅡmRNA、AT1mRNA及蛋白表达水平均明显低于模型组(P＜0.05，P＜0.01)。见图1、图2。

3 讨论

近年研究表明，在心血管组织以外的消化道、肝、肺、皮肤等的局部组织和器官中也独立存在着RAS，局部组织的RAS也可合成AngⅡ[8-9]。AngⅡ除调节血液动力学作用外，还作为一种促纤维化因子和生长因子影响细胞的增殖和分裂[10]。AngⅡ是通过与组织细胞上特异性的受体结合，发挥促细胞增殖和ECM合成的作用的[10-11]。研究发现肝纤维化患者中AngⅡ的升高与纤维化程度有关，肝纤维化形成过中血浆及肝组织中AngⅡ水平与纤维化程度呈明显正相关，AT1基因表达量也随着纤维化程度的增加而增强多，ACE活性在纤维化肝组织中也显著升高[12-13]。

图1 各组大鼠肝脏AngⅡmNRA、AT1mRNA表达（n=8）

图2 各组大鼠肝脏AT1蛋白表达（n=8）

Hyp是胶原蛋白所特有的氨基酸，测定肝组织中Hyp的量可衡量胶原总体水平，间接反映肝纤维化的程度，是肝纤维化检测的重要指标，本研究发现肝纤维化模型组大鼠肝组织Hyp水平较正常组显著增高（P＜0.01），表明模型大鼠肝组织胶原沉积增多；病理组织学Masson染色也发现模型组大鼠肝组织纤维胶原沉积明显增多（P＜0.01）。研究同时发现，模型组大鼠血浆AngⅡ、ACE水平较正常组显著升高（P＜0.01），肝组织AngⅡmRNA、AT1RmRNA和蛋白的表达均较正常组明显升高（P＜0.01）；提示AngⅡ和AT1R可能参与CCl4肝纤维化的发生和发展。以不同剂量的GbE干预6周后，大鼠肝组织Hyp水平较模型组明显减少（P＜0.05，P＜0.01），血浆AngⅡ、ACE水平较模型组明显降低（P＜0.05，P＜0.01），肝组织AngⅡmRNA、AT1mRNA和蛋白的表达均较模型组明显降低。综合实验得出的结论，结合前期研究GbE能抑制肝星状细胞的激活和转化，降低肝组织TGF-ß1表达[5]，提示GbE可以抑制RAS系统的反应，可能通过降低肝组织AngⅡ水平，引起AngⅡ受体AT1的密度减低，抑制肝内AngⅡ与AT1R相结合，显著降低TGF-ß1等的表达和分泌，抑制TGF-β1的致纤维化效应达到抗肝纤维化作用。研究结论为揭示银杏叶提取物抗肝纤维化的作用机制提供了实验基础。

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