张 亚 刘 青 刘双清 廖晓兰，3*

（1湖南农业大学植物保护学院，湖南长沙 410128；2植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南长沙 410128；3湖南省生物农药与农药制剂加工工程技术研究中心，湖南长沙 410128）

草莓灰霉病是危害草莓生产的重要病害，每年由该病造成的经济损失可达10%～30%，有的甚至高达89%（Ugolini et al.，2014）。该病的寄主范围广泛，不仅可以侵染草莓，而且还可侵染番茄、黄瓜、辣椒、葡萄等多种植物（Williamson et al.，2007；Zhang et al.，2014）。生产上防控草莓灰霉病的方法主要包括农业防治（清除病残体、调控温湿度、通风透光、紫外照射）、生物防治（以菌制菌）、化学防治（利用合成农药）等，其中化学防治具有见效快、节约成本等优势，一直是控制草莓灰霉病的重要方法（Rosslenbroich & Stuebler，2000；Huang et al.，2012；吉沐祥 等，2013；Shao et al.，2015；Aqueveque et al.，2016；Janisiewicz et al.，2016）。目前防治草莓灰霉病的化学药剂主要有多菌灵、腐霉利、异菌脲、嘧霉胺等，但长期大量使用化学药剂不仅污染土壤，破坏生态平衡，造成农药残留，而且容易使病菌产生抗药性（Hunter et al.，1987；Yourman & Jeffers，1999；Dianez et al.，2002）。研究表明，草莓灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、异菌脲、乙霉威、嘧霉胺等药剂已经产生了抗药性，因此迫切需要通过复配技术降低草莓灰霉病菌的抗药性，延缓药剂的使用寿命（周明国等，1990；韩巨才 等，2004；陈莉 等，2007；礼茜 等，2007；陈仁 等，2015）。

啶酰菌胺是一种线粒体呼吸抑制剂，通过抑制线粒体电子传递链上琥珀酸辅酶Q还原酶活性达到控制病菌菌丝生长的作用，其作用机理与其他酰胺类和苯甲酰胺类杀菌剂类似（颜范勇 等，2008；冯小龙，2016）。咯菌腈通过抑制葡萄糖磷酰化有关的转移酶，最终导致病菌死亡，其作用机理独特，与现有杀菌剂无交互抗性（杨玉柱和焦必宁，2007）。这两种药剂都是生产上常用于防治草莓灰霉病的化学药剂，本试验拟通过复配技术筛选出对草莓灰霉病菌具有增效作用的复合物，并进行田间防效试验，旨在为今后防控草莓灰霉病提供用药依据。

1 材料与方法

室内毒力测定和田间药效评价于2016～2017年分别在湖南农业大学植物保护学院生物农药工程中心和衡阳市衡东县新塘镇草莓种植示范基地进行。

1.1 试验材料与药剂

供试菌株为草莓灰霉病野生菌株（Botrytis cinerea），由湖南农业大学植物保护学院生物农药课题组从发病的草莓病果上分离获得纯种菌株（刘双清 等，2016）。

供试药剂为98.51%啶酰菌胺原药，购自上海秦巴化工股份有限责任公司；98%咯菌腈原药，购自北京伊诺凯科技有限公司；50%啶酰菌胺可湿性粉剂（推荐用药浓度为0.60 mg·mL-1），购自巴斯夫（中国）有限公司；50%咯菌腈可湿性粉剂（推荐用药浓度为0.05 mg·mL-1），购自先正达（苏州）作物保护有限公司；50%腐霉利可湿性粉剂（推荐用药浓度为0.80 mg·mL-1），购自海南正业中农高科股份有限公司；乙醇、丙酮、吐温-80、葡萄糖、琼脂、NaOH、HCl等化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

参考方中达（1998）的方法配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）。

1.2 试验仪器

ME204E分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司），Eppendorf移液枪（艾本德中国有限公司），LDZX-30E灭菌锅（上海申安医疗器械厂），YJ-VS-2型超净工作台（无锡一净净化设备有限公司），MPJ-250型培养箱（上海森信实验仪器有限公司），电炉（北京中兴伟业仪器有限公司）以及量筒、玻璃棒、烧杯、三角瓶、直尺、铅笔、标签纸、封口膜、挑针、容量瓶、接种针、打孔器、培养皿、菜刀、纱布等。

1.3 试验方法

1.3.1 室内毒力测定 采用生长速率法测定药剂对草莓灰霉病菌的抑制作用（凌金峰 等，2016）。取适量丙酮将啶酰菌胺和咯菌腈原药溶解，制备成浓度为100 μg·mL-1的母液。将啶酰菌胺和咯菌腈分别按照 1∶1、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2：1、3∶2的质量比配成混合液，无菌水稀释，并加入适量吐温-80使药剂均匀分布于水相中，将药液与培养基按1∶9的体积比配制成最终含药量为 0.001、0.01、0.1、1、10 μg·mL-1的含药平板，同时设无药平板为对照。用打孔器在预培养48 h的菌落边缘打取菌饼，正面朝下接种到含药平板上，每处理3次重复，置于20 ℃培养箱中，黑暗培养72 h后，采用十字交叉法测量各处理菌落直径。计算各处理浓度的抑制率，并采用DPS6.55软件的专业统计方法进行生物测定分析，明确啶酰菌胺、咯菌腈及其复配物的毒力回归方程，EC50值和相关系数。试验共进行2次。采用Wadley法进行增效作用评价（农业部农药检定所，2006）。当增效系数SR＞1.5为增效作用；0.5≤SR≤1.5为相加作用；SR＜0.5为拮抗作用。

式中：A、B分别代表两种药剂，a、b分别代表两种药剂在混剂中所占比例，ob为实际观察值，th为理论值。

1.3.2 田间药效试验 田间试验在湖南省衡阳市衡东县新塘镇草莓基地进行，选择草莓灰霉病历年发生均匀且发病较重的大棚，草莓品种为红颜，株距30～38 cm，土壤肥力中等，草莓长势均匀一致。试验共设5个处理，50%啶酰菌胺可湿性粉剂（T1）、50%咯菌腈可湿性粉剂（T2）、50%啶酰菌胺可湿性粉剂和50%咯菌腈可湿性粉剂复配物（质量比为3∶1，该比例对草莓灰霉病菌的增效作用最明显）（T3），以50%腐霉利可湿性粉剂为药剂对照（CK1），清水作为空白对照（CK0）。每处理3次重复，共15小区，采用完全随机排列，小区面积10 m2。采用辉腾3WBS-20A型背负式手动喷雾器均匀喷施药剂，每小区施药液750 mL左右。草莓普遍开花结果初期，病害发生前施药3次，每次间隔7 d，并于第3次施药后7～10 d，根据草莓灰霉病田间试验标准调查复配物对草莓的药害情况、病果率，计算防治效果。

1.4 数据分析

原始数据经Excel软件进行初步处理，采用DPS6.55软件的专业统计方法对室内毒力数据进行生物测定分析，获得药剂的EC50、回归方程以及相关系数；采用DPS6.55软件的试验统计方法对田间防效数据进行单因素完全随机方差分析，明确不同药剂处理之间差异。

2 结果与分析

2.1 啶酰菌胺与咯菌腈复配对草莓灰霉病菌的抑制作用

由表1可知，啶酰菌胺和咯菌腈均对草莓灰霉病菌具有抑制作用，其中咯菌腈的毒力高于啶酰菌胺，其抑制中浓度远低于啶酰菌胺。当咯菌腈的含量≥啶酰菌胺时，其在复配物中所占的比例越高，增效系数越低：当啶酰菌胺和咯菌腈复配比例为1∶1时，表现增效作用；当啶酰菌胺和咯菌腈复配比例为1∶3、1∶4、1∶5时，均表现相加作用。当啶酰菌胺和咯菌腈复配比例为3∶2、2：1、3∶1、5∶1时均表现增效作用，但比例为4∶1时则表现相加作用，这可能跟菌株在培养箱中放置的位置有关。3∶1复配的增效系数为4.47，增效作用最明显。

2.2 啶酰菌胺与咯菌腈复配对草莓灰霉病的田间防治效果

由表2可知，啶酰菌胺和咯菌腈按照质量比3∶1复配（T3）可以显著降低草莓灰霉病的发病率，对草莓灰霉病具有较好的控制效果，两年防效均达70%以上，显著高于腐霉利的药剂对照。经过田间观察发现，无论是复配物还是单剂均未对草莓正常生长产生不利影响。

表1 啶酰菌胺和咯菌腈复配对草莓灰霉病的室内毒力测定

表2 啶酰菌胺与咯菌腈复配对草莓灰霉病的防治效果

3 结论与讨论

草莓灰霉病菌适合度高、变异大、繁殖速度快，是高抗风险的病原物，已对多种农药产生了抗性（陈治芳 等，2010）。将作用机理不同的农药进行复配对延缓草莓灰霉病菌抗药性具有重要意义。本试验首次将啶酰菌胺和咯菌腈两种作用机理不同的药剂进行复配，结果表明啶酰菌胺和咯菌腈以质量比3∶1复配对草莓灰霉病菌的增效作用最明显，这个结果不仅有助于延长两种药剂的使用寿命，而且丰富了防治草莓灰霉病的新药剂。啶酰菌胺和咯菌腈复配时，咯菌腈的量与增效系数呈反比，但啶酰菌胺的量与增效系数无明显规律，与赵建江等（2016）的研究结果一致。这一现象可能与Wadley计算方法有关。本试验结果表明，无论啶酰菌胺和咯菌腈如何复配，其对草莓灰霉病菌都具有相加作用或增效作用，说明二者复配协同效果较好，具有开发潜力，可进一步研制剂型，创制新的农药品种。

本试验仅研究了啶酰菌胺和咯菌腈复配物对草莓灰霉病菌的防治效果，而这两种药剂对其他病原菌，如疫霉病菌、炭疽病菌、纹枯病菌、黄萎病菌等是否也具有增效作用，值得进一步研究。目前，复配物的增效机理普遍认为是一种药剂干扰了病原菌对另一种药剂的解毒和代谢作用（毕秋艳和马志强，2010）。本试验暂未考察啶酰菌胺和咯菌腈复配物的增效机理，究竟是啶酰菌胺还是咯菌腈首先发挥作用，或是两者是否同时发挥作用等，也有待今后研究。

一种农药能否用于生产，必须要进行室内生物活性测试和田间试验。本试验两年的田间试验结果表明：啶酰菌胺和咯菌腈复配对草莓灰霉病的最佳防效可达74.40%，优于单一施用的效果。研究表明，复配物暗罗-丁子香酚对草莓灰霉病的田间防效为73.91%（吉沐祥 等，2009）；施用腐霉利7 d对草莓灰霉病的防效为68.05%（张颂函 等，2015）；复配物氟菌-肟菌酯对草莓灰霉病的防效低于70%（武雯 等，2015）。本试验复配药剂的防效高于前人的研究结果。此外，啶酰菌胺和咯菌腈两种药剂已有成熟的合成技术，原材料获得方便，价格适中，操作简单，节省劳力等，为今后的复配研究奠定了物质基础。综合以上几点，啶酰菌胺和咯菌腈复配具有开发和应用的潜力，未来可以在生产上推广应用。

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