徐淑菲，孔繁德，苗 丽，林双庆

（1. 厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361026；2. 河南出入境检验检疫局，河南郑州 450003）

肉和肉制品中的“掺杂使假”是食品质量控 制面临的主要挑战之一[1]，也是消费者投诉的焦点之一。由于价格差异带来的利益诱惑，驱使一些不法商贩或企业在牛、羊、鹿等高价肉制品中掺杂一些低价值的肉原料，如猪肉、鸡肉、鸭肉，以及皮毛类动物肉，如狐狸、水貂、海狸鼠、貉等，甚至还用鼠肉充当羊肉，或者将低价肉经过香精处理后冒充高价肉[2-3]。这些“掺杂使假”行为不仅侵害了消费者权益，有时还涉及到民族问题或是宗教问题，从而造成恶劣的社会影响。如果问题产品出口到国外，则会损害我国食品企业的整体形象，从而影响出口贸易[4]。尽管国外食品生产有较严格的可追溯程序（即每份产品中的所有成分都可以追溯到来源养殖场，所有中间环节产品处理也可以追溯到相关供应商），但也有类似的肉类掺假报道，同样使人担忧。为了快速鉴别牛羊肉中是否掺杂了鸡肉、鸭肉等其他肉类，本文建立了比PCR和qPCR更为快速简便的荧光LAMP方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集和处理 试验所用的鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、犬血液、鸽子、鱿鱼、罗非鱼等：厦门出入境检验检疫局动物检疫实验室检验项目样品；山羊肉、绵羊肉：购自厦门市市场；鼠肉：来自实验用动物；狐狸肉：河南出入境检验检疫局提供；TaKaRa马核酸、TaKaRa兔核酸：宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.1.2 主要试剂和仪器 组织DNA提取试剂盒：LabServ公司产品；IMM（Isothermal master mix）试剂：北京晟泰勃科技有限公司产品；2×Taq PCR MasterMix、DL 2000 DNA Marker：TaKaRa公司产品；Veriti 96孔型PCR仪：ABI公司；Genie II等温扩增荧光检测系统：OptiGene公司；Biophotometer plus型核酸蛋白测定仪：Eppendorf公司。

1.1.3 引物

1.1.3.1 LAMP引物序列 对不同动物的线粒体基因序列进行比对，选取鸡、鸭CytB基因作为鸡或鸭源性成分的检测基因，对应的GenBank号分别为AY029583.1、EU585609.1（表1）。

1.1.3.2 vLAMP扩增片段 红色粗字体为外引物猪F3序列和猪B3的颠倒互补序列，红色粗字体之间的基因序列为LAMP扩增片段（表2）。

1.1.3.3 PCR引物 根据文献[5]中的鸡鸭特异性引物序列合成引物。鸡扩增片段大小为256 bp，鸭扩增片段大小为292 bp（表3）。

表1 LAMP引物序列

表2 鸡、鸭CytB基因LAMP扩增片断

表3 PCR引物序列

1.1.3.4 引物浓度 鸡FIP、BIP，鸭FIP、BIP均为20 µmol/L；鸡F3、B3、LoopB、loopF，鸭F3、B3、LoopB、loopF均为10 µmol/L。PCR所有引物浓度均为10 µmol/L。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 按照LabServ公司生产的组织DNA提取试剂盒说明书，提取各样品DNA。经核酸蛋白测定仪测定，鸡肉、鸭肉提取的核酸浓度分别为2.2×102、8.3×102µg/mL。

1.2.2 LAMP方法的建立及优化 参考本课题组牛、羊、猪源性成分LAMP方法优化的过程及方案，将鸡、鸭源性成分LAMP检测的反应组分进行内外引物工作浓度比优化、引物工作浓度优化、Loop引物加速试验和反应温度优化等试验[6-7]。

1.2.3 溶解曲线 根据优化后的最佳反应体系和条件进行本试验。对鸡（或鸭）源性成分的LAMP检测进行2个重复，设置1个空白对照。

1.2.4 灵敏度试验 将鸡、鸭源性成分核酸分别进行10倍连续梯度稀释。稀释倍数依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

1.2.4.1 LAMP方法 根据优化的最佳反应体系和条件进行。反应管内依次加入10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释的对应鸡（或鸭）源性成分核酸1 µL，补充水至25 µL。

1.2.4.2 PCR方法 反应体系包括：2×Taq PCR MasterMix 12.5 µL，引物各1 µL，依次加入10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释的鸡或鸭源性成分核酸各1 µL，补充水至25 µL。反应条件：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 3 min。

1.2.5 特异性试验 根据优化后的最佳反应体系和条件进行本试验。第1～15管依次加入鸡核酸、鸭核酸、猪核酸、绵羊核酸、鼠核酸、狐核酸、TaKaRa马核酸、罗非鱼核酸、鱿鱼核酸、鸽核酸、犬核酸、山羊核酸、牛核酸、TaKaRa兔核酸各1 µL，补充水至25 µL。

2 结果与分析

2.1 LAMP方法优化

鸡或鸭源性成分LAMP检测方法的内外引物最佳工作浓度比（FIP+BIP）∶（F3+B3）均为4∶1（图1）；引物FIP、BIP、F3、B3的最佳工作浓度分别为1.6、1.6、0.4、0.4 µmol/L（图2）。对于鸡源性成分LAMP检测方法，63～68 ℃均可得到较好的试验结果；对于鸭源性成分LAMP检测方法，最佳反应温度范围为62～65 ℃（图3）。

图1 内外引物工作浓度比的优化

图2 引物FIP、BIP、F3、B3工作浓度优化

A. 鸡源性成分检测LAMP方法；B. 鸭源性成分检测LAMP方法；1. 工作浓度分别为0.4、0.4、0.1、0.1 µmol/L；2. 工作浓度分别为0.8、0.8、0.2、0.2 µmol/L；3. 工作浓度分别为1.6、1.6、0.4、0.4 µmol/L；4. 工作浓度分别为3.2、3.2、0.8、0.8 µmol/L；5. 工作浓度分别为6.4、6.4、1.6、1.6 µmol/L；6. 工作浓度分别为12.8、12.8、3.2、3.2 µmol/L；7、8. 空白对照

图3 方法反应条件优化

鸡或鸭源性成分LAMP检测方法的加速引物试验证明，加速双引物的加速作用强于加速单引物；两条加速单引物的加速作用相似；无加速引物的反应所需反应时间最久（图4）。加速引物的加速作用仅限于加快反应速度，缩短反应时间，并不会增加假阳性概率。加速单引物可以使反应时间缩短一半左右，反应时间应该适当缩短，可设置为20 min左右；加速双引物可以使反应时间缩短2/3左右，反应时间可设置为15 min左右。

LAMP方法中的溶解曲线是报告中的退火导数（Anneal derivative）。鸡、鸭LAMP的溶解曲线的峰值分别为87.1、85.2 ℃，均只有1个峰，且重复性良好，进一步佐证了鸡、鸭LAMP方法的可信度（图5）。

图4 Loop引物的加速结果

图5 溶解曲线

2.2 灵敏度

鸡鸭源性成分LAMP检测方法：10-1～10-4倍稀释的核酸孔均出现典型的扩增曲线，10-4倍稀释的核酸孔出现扩增曲线，30 min内未出现Ct值，延长时间会出现Ct值。鸡源性成分PCR检测方法：10-1～10-3倍稀释的核酸孔均出现清晰的256 bp的目的条带。两者LAMP方法的灵敏度比PCR方法高10倍。鸭源性成分LAMP检测方法：10-1～10-4倍稀释的核酸均出现典型的扩增曲线，30 min内均出现Ct值；鸭源性成分PCR检测方法：10-1～10-3倍稀释的核酸孔均出现清晰的292 bp的目的条带。鸭源性成分LAMP检测方法比PCR方法更灵敏（图6、表4）。

图6 灵敏度试验

表4 灵敏度试验结果

2.3 特异性

鸡鸭源性成分LAMP检测方法只有相对应的反应孔有典型的扩增曲线，其他11种动物核酸均未出现扩增曲线（图7）。由此可见，本文建立的鸡鸭动物源性成分LAMP检测方法具有良好的特异性，结合溶解曲线只有1个峰值，说明该方法具有更高的可信度。

2.4 应用

对市场上50份牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉制品等进行了鸡鸭源性成分检测。在市场中的牛肉、羊肉制品中未发现鸡鸭源性成分；在鸡肉制品中检出鸡源性成分，鸭肉制品中检出鸭源性成分。应用结果说明该方法特异性较好，可以用于市场检测。而且本文建立的方法和PCR方法检测结果一致。

图7 LAMP检测方法特异性分析

3 讨论

传统的LAMP方法灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级），反应时间短（30～60 min就能完成反应），临床使用不需要特殊的仪器，操作简单。但传统的LAMP方法也有缺点：（1）反应完毕开盖加荧光染料，易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，使得假阳性问题较严重；（2）肉眼观察判定结果的主观性强，对于弱阳性试验，易出现错判；（3）引物设计要求高。

为了克服传统LAMP方法的缺点，本文建立了检测鸡鸭源性成分的荧光LAMP方法。这是在传统LAMP方法的基础上，通过等温扩增荧光检测系统完成的。核酸等温扩增技术与生物荧光检测技术相结合，通过对温度的精确控制，使核酸在恒温条件下进行快速扩增，扩增过程中荧光激发和检测系统完成对扩增过程的实时动态监控，通过实时扩增曲线和产物溶解曲线，判定阴阳性并分析实验结果。本方法也兼容多种荧光指示剂，如生物荧光，荧光染料，钙黄绿素和荧光探针等。

相对于传统的LAMP方法，本文建立的方法优点：（1）反应时间更短（最快仅需15～20 min；10 min左右就可进行实时初判）；（2）通过实时扩增曲线和产物溶解曲线判定阴阳性并分析实验结果，更可靠；（3）反应前加入染料，不需二次开盖，减少了污染。其缺点和传统的LAMP一样，对引物设计要求高。

本文在建立了牛、羊、猪源性成分LAMP检测方法的基础上，进一步建立了鸡鸭源性成分LAMP检测方法。对照最佳反应体系发现，最佳内外引物工作浓度比（FIP+BIP）∶（F3+B3）均为4∶1，最佳引物FIP、BIP、F3、B3工作浓度均分别为1.6、1.6、0.4、0.4 µmol/L。牛、猪、鸡和鸭源性成分的最佳扩增反应温度范围分别为64～66、65～68、63～68、62～65 ℃，默认扩增反应温度是65 ℃。故这4种动物源性成分检测的LAMP方法均采用65 ℃作为扩增反应温度。羊最佳扩增反应温度范围为66～68 ℃，选择最接近默认扩增反应温度的66 ℃作为扩增反应温度。

为防止污染，本试验在操作过程中，将核酸样本加样区和其他试剂加样区分别设在2个PCR专用超净工作台。除核酸样本外的其他试剂加入到反应管后，盖好盖子，然后移至核酸样本加样区，打开盖子并加入对应的核酸样本后，立即盖紧盖子，再操作下一个核酸样本，避免交叉污染。核酸样本加样顺序为空白对照、阴性对照、各反应核酸样本、阳性对照。

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