黄建龙，王昌建，邓国华，何世成，宁华杰，张朝阳，林 源

（1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410014；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，农业部动物流感重点开放实验室，兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001；3.长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410013）

禽流感是由正黏病毒科流感病毒属A型禽流行性感冒病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）传染病。迄今为止，共有16种HA（H1～H16）亚型和9种NA（N1～N9）亚型被鉴定[1]。禽流感病毒不仅严重影响养殖业的发展，也在其长期进化变异过程中逐步获得了跨越种间障碍感染哺乳动物的能力，对公共卫生安全形成较大威胁。有报道称，H6亚型禽流感病毒不仅可以向H5亚型和H9N2亚型禽流感病毒提供内部基因片段，而且可以感染鼠、水貂和人[2]。近年来，我国南方地区相继出现人H9N2亚型禽流感感染病例[3]。2013年3月底上海市首次出现人H7N9亚型流感疫情[4]。至今，我国已经发生5波H7N9亚型流感疫情，截止到2017年7月，共有1 500多人感染，死亡率约为38%[5]。

有研究显示，活禽市场在禽流感病毒的存留、繁殖以及传播过程中扮演着十分重要的角色[6-7]，是人感染H7N9 流感病毒的危险因素[8]。为全面了解和掌握湖南省长沙市活禽批发市场禽流感病毒污染状况，便于有针对性地进行禽流感防控，保障人类健康和公共卫生安全，分别于2015年和2016年的冬春季节，对长沙市两大活禽批发市场进行了禽流感流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 样品采集

按照简单随机抽样方法，分别在冬季和春季，到长沙市两大活禽批发市场采样。每个市场每次简单随机抽取10个摊位，每个摊位采集10份家禽咽喉或泄殖腔拭子，每次采集10～20份环境拭子。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs和分子量Marker：购自宝生物工程（大连）有限公司；反转录酶、LS TRIzol RNA提取试剂：购自Invitrogen公司。

1.3 鸡胚

SPF鸡胚：购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.4 病原分离和鉴定

将拭子样品1 000 r/min 离心5 min，吸取上清液；以每胚0.2 mL的注射剂量，由尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，每个样品接种2～3枚，37 ℃孵育，每天观察2次；弃去24 h内死亡的鸡胚，及时收集之后死亡的鸡胚，至96 h收集所有鸡胚，置于4 ℃过夜；收获鸡胚尿囊液，用血凝试验（HA）测定；对阴性者再盲传1代。如果HA仍为阴性，则终定为阴性样品。对HA测定有滴度的样品，再采用血凝抑制试验（HI）和RT-PCR相结合方法鉴定病毒。

1.5 统计分析

应用Microsoft excel软件进行统计分析。群阳性率=（阳性群数/采集的群体数）×100%；病毒分离率=（病毒分离数/采集的拭子样品数）×100%；鸡拭子病毒分离率=（鸡拭子病毒分离数/采集的鸡拭子样品数）×100%；鸭拭子病毒分离率=（鸭拭子病毒分离数/采集的鸭拭子样品数）×100%；环境拭子病毒分离率=（环境拭子病毒分离数/采集的环境拭子样品数）×100%。

2 检测结果

2.1 总体检测情况

分别在2015年和2016年的冬春季节，对长沙市活禽批发市场进行了禽流感流行病学调查，共在78个摊位（每个摊位作为1个群体）采集禽拭子样品进行禽流感病原分离，结果在35个摊位分离到禽流感病毒，群阳性率为43.6%；共采集920份禽拭子和环境拭子样品进行病原分离鉴定，发现131份为禽流感病毒阳性，禽流感病毒总分离率为14.24%（表1）。

表1 2015—2016年长沙市两大活禽市场禽流感检测结果

2.2 不同HA亚型禽流感病毒分离率

在两年的持续监测过程中，在活禽批发市场中，共分离出6种亚型禽流感病毒，分别为H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型。其中，H9亚型和H5亚型分离率较高，分别为8.7%和3.8%（图1）。

图1 活禽批发市场中不同HA亚型禽流感病毒分离率

2.3 鸡、鸭和环境拭子禽流感病原分离情况

在4次持续监测中，发现鸡、鸭和环境拭子的禽流感病毒分离率分别为11.25%、15.00%和22.85%。在鸡拭子中分离到H5和H9两种亚型禽流感病毒，其中H9亚型病毒分离率最高，为11.04%；在鸭拭子中分离到H3、H5、H6、H7、H9和H10等6种亚型禽流感病毒，其中H5亚型病毒分离率最高，为8.33%；在环境拭子中分离到H3、H5、H6和H9等4种亚型禽流感病毒，其中H9亚型病毒分离率最高，为12.14%（图2）。

图2 活禽批发市场鸡、鸭和环境拭子禽流感病毒分离率

3 结果分析

此次流行病学调查共在长沙市2大活禽批发市场的35个摊位分离到禽流感病毒，群阳性率达43.6%，分离到H3、H5、H6、H7、H9和H10等6种亚型的禽流感病毒，禽流感病毒总分离率为14.24%。该结果表明长沙市活禽批发市场中的禽流感病毒污染面较广。这与其他学者对相关省市活禽市场的研究结果基本相符[9-13]，说明活禽市场是禽流感病毒的重要污染地。

此次调查中，第3次调查（2016年5月）所采集样品的禽流感病毒分离率较高。这可能与采集的样品有关。第3次调查采集的样品中，淘汰蛋鸡的拭子较多（140份），且分离到的禽流感病毒都为H9亚型。第4次调查（2016年11月）所采集样品的禽流感病毒分离率最低。这是因为长沙市为做好H7N9流感防控工作，加强了活禽市场管理，对市场的清洗消毒到位，从而有效减少了市场中的禽流感病毒数量。这也进一步说明，只要严格落实农业部的“1110”制度（一日一清洗、一周一消毒、一月一休市、过夜零存栏），市场中的禽流感病毒就可以得到有效杀灭或消除。

水禽特别是家鸭是禽流感病毒的储存库和传染源，在动物间的禽流感传播中起着十分重要的作用。在对长沙市活禽批发市场所采集的鸭拭子进行检测时发现，鸭拭子中检测到的病毒亚型最多，共有H3、H5、H6、H7、H9和H10等6种亚型。这为各亚型流感病毒间的基因重组提供了很好的机会。因此，必须尽量防止野生水禽、家养水禽及其它野鸟与陆禽的相互接触；水禽和其它禽类应分别建立市场，独立经营。

长沙市活禽市场中的H9亚型禽流感病原阳性率最高。虽然H9N2 亚型禽流感病毒属于低致病性病毒，但有潜在威胁，公共卫生意义重大。有研究显示：大部分H9N2病毒具备结合人样流感受体的能力，对人具有一定的潜在威胁[14]，并且已有多人感染H9N2病毒[3]；2013 年感染人的H7N9 病毒内部基因来自H9N2 亚型禽流感病毒[15]。因此，应加强活禽市场H9亚型禽流感的监测。

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