张 月 王耀一 孙光源 姜伟华 孙 健 范敬静 张志生 信国峰 宋文丽 费建东

(河北北方学院附属第一医院乳腺外科，河北 张家口 075000)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其治疗已规范化，靶向治疗成为大趋势。化疗药物治疗效果明显，但副作用大；靶向治疗针对靶点，治疗明确。Aurora 激酶、Bcl-2家族作为新的靶点，以它们为靶点治疗的联合应用为乳腺癌治疗开辟了新思路。本研究主要检测ABT737增强ZM447439抑制人乳腺癌细胞的增殖效应，诱导凋亡并且初步探讨与其相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 人乳腺癌细胞株T47D、MDA-MB-231由河北北方学院中心实验室提供；ZM447439、ABT737购自selleck公司；RPMI 1640培养基购自Gibico公司；胎牛血清购自Hyclone公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析试剂盒购自美国Pierce公司；p-AuroraA、 p-组蛋白(Histone)H3、AuroraA、HistoneH3、细胞周期蛋白(Cyclin)B1、p-cdc25c、cdc25c、p-cdc2、cdc2、p21、p53 Bax、Bcl-2、Bcl-xl、PARP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3一抗购于美国Cell Signaling Technology公司。

1.2细胞培养 T47D、MDA-MB-231细胞株常规培养于RPMI1640培养液中，内加10%胎牛血清、人青霉素(浓度100 U/ml)和链霉素(浓度100 μg/ml)，于37℃、 5% CO2培养箱中培养。分为对照组和实验组(含ZM447439的RPMI 1640培养液)，设计ZM447439浓度分别为0、100 μmol/L处理24 h，倒置显微镜观察细胞形态的变化。

1.33-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)测定细胞活性 将细胞接种于96孔板(1×104个/孔)，每组设3个平行孔，细胞按分组处理后，更换新鲜培养液(200 μl)；每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)孵育4 h，弃培养液，加入200 μl二甲基亚砜，震荡混匀，待颗粒溶解后，酶标仪波长570 nm处检测各孔光浓度值 (OD值)。

1.4克隆形成实验检测细胞增殖 处理细胞悬液，保证6孔板每孔细胞50个左右。将其分为对照组和实验组处理4 h后，弃去，RPMI1640培养液培养15 d后，弃去；预冷磷酸盐缓冲液(PBS)轻晃立即弃去；加10%甲醇固定30 min，然后用PBS洗涤至甲醇干净，自然晾干，加入0.1%结晶紫对细胞染色30 min后用蒸馏水洗涤，置于空气中到干燥为止，采图。

1.5免疫荧光观察纺锤体及核的改变 对细胞进行消化、计数，调整细胞密度至103/ml。把预先处理的无菌玻片放入12孔板中，将以上细胞悬液滴入每孔(保证每孔为2 ml)，放入37℃、5% CO2孵箱中培养过夜使其贴壁。给予ZM447439 1 μmol/L处理48 h后，将培养液弃去；用预冷的1倍PBS洗3次(5 min/次)，经4%多聚甲醛固定、0.2%Triton-X100破膜、DAPI着色5～10 min，1倍PBS洗3次后封片，在荧光显微镜下观察，共聚焦显微镜下采图。

1.6Western印迹检测蛋白表达 提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取30 μg总蛋白行10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转法将蛋白电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温纤维素膜用含5%牛奶TBST封闭0.5 h；加入一抗(稀释比例为1∶1 000其中β-actin抗体稀释比例为1∶10 000)4℃过夜；TBST洗涤 3次，然后与二抗(辣根过氧化物酶标记，稀释比例1∶10 000)室温孵育1 h后TBST洗涤3次；电化学发光法(ECL)显影，曝光。

1.7流式细胞术检测细胞周期 分别用对照组(未处理)、抑制剂组(ZM447439 0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L)处理T47D 、MDA-MB-231 24 h，1 μmol/L作用48 h后，收集细胞并调整细胞数至1×106个/ml，用冷PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min两次；预冷的95%乙醇固定，离心乙醇固定的细胞，弃去乙醇，加入PI(50 μg/ml)与RNase(1 μg/ml)混合物500 μl作用15 min后，在流式细胞仪上机分析，检测1×104个细胞，并用multicycle软件进行细胞周期的分析。

1.8荧光染色观察细胞形态学变化 分别用对照组(未处理)、实验组处理T47D细胞72 h后，分别加入终浓度为5 μg/ml的Hoechst33342、 250 nmol/L的 MitoTracker Red和1 μmol/L的Yo-pro-1，室温孵育30 min后，倒置荧光显微镜下观察。 Yo-pro-1可透过凋亡细胞的细胞膜，但不能透过活细胞的细胞膜。

1.9流式细胞术检测细胞凋亡率 分别用对照组(未处理)、实验组分别处理T47D 48 h后，收集细胞，并调整的细胞数至1×106个/ml，用冷PBS洗涤细胞两次。加入结合缓冲液100 μl、FITC Annexin-Ⅴ 5 μl、PI(50 μg/ml)10 μl，室温避光孵育15 min后加入结合缓冲液400 μl细胞悬液中加入孵育20～30 min。流式细胞仪FACScan测定，经计算机软件处理计算凋亡细胞百分率。

1.10统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1ZM447439抑制乳腺癌细胞生长及增殖 MTT法显示随着浓度和时间增加ZM447439呈现明显的量效关系，24、48、72 h的IC50值分别为(8.01±0.96)、(3.62±0.41)、(0.42±0.11)μmol/L(图1)；克隆形成实验结果显示，随着ZM447439浓度的增加克隆形成的数目减少(图2)。倒置显微镜下观察，100 μmol/LZM447439作用24 h，T47D、MDA-MB-231细胞出现细胞皱缩、破裂，失去正常形态，细胞内出现空泡及颗粒，细胞间隙增大，部分细胞失去贴壁能力，细胞数量未见增加。见图3。

图1 MTT检测不同浓度不同时间ZM447439对T47D细胞抑制率曲线

图2 ZM447439对T47D、MDA-MB-231对细胞克隆形成的影响

2.2ZM447439对P-Histome H3、P-AuroraA及周期特异性、调节性指标的影响 P-Aurora A、P-Histone的表达随着ZM447439浓度增加逐渐减弱，Cyclin B1、p-cdc25c、p-cdc2、p21、p53是G2/M期的周期特异性及调节性指标，随着ZM447439浓度增加，CyclinB1的表达逐渐减少；其他指标的表达逐渐增加(图4)。

2.3ZM447439对乳腺癌细胞核纺锤体的影响及多核细胞的形成 ZM447439 0、1 μmol/L作用于T47D 48 h，纺锤体的结构紊乱、细胞核出现改变；在没有ZM447439的作用下，MDA-MB-231细胞核分布均匀，无明显分叶的变化。经1 μmol/L ZM447439作用48 h后，细胞核出现分叶状，产生多核细胞。见图5，图6。

图3 两组T47D、MDAMB-231在倒置显微镜下的细胞形态(×40)

图4 ZM447439对Aurora A、HistoneH3自身磷酸化及周期特异性指标的影响

图5 ZM447439对乳腺癌T47D细胞核纺锤体的影响及多核细胞的形成(×200)

2.4流式细胞术对DNA倍体分析 1 μmol/L ZM447439作用48 h，乳腺癌细胞产生多倍体(图7)。T47D、MDA-MB-231细胞系在ZM447439不同浓度作用下，G0/G1、S期细胞百分比减少，G2/M期细胞百分比增加；G2/M期细胞占细胞总数的百分比随着浓度的增加有明显增多的趋势，而相对应G0/G1期、S期细胞占细胞总数的百分比减少，见表1。

2.5ABT737与ZM447439对乳腺癌细胞的影响 不同浓度ZM447439作用不同时间，PARP的剪切带呈现浓度及时间的依赖性。不同浓度ZM447439加入1 μmol/L ABT737作用48 h，PARP、Caspase3剪切带明显增加，Bax表达增加，Bcl-2表达减少,见图8。荧光染料及FITC Annexin-Ⅴ流式细胞术显示，1 μmol/L ABT737+1 μmol/L ZM447439联合组作用48 h细胞凋亡率〔(4%5.30±0.32)%〕明显高于对照组、1 μmol/L ABT737及1 μmol/L ZM447439作用48 h的(0.31±0.03)%、(17.46±0.39)%、(28.21±0.48)，见图9。

图7 流式细胞术对DNA倍体分析

1～6：0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L ZM447439图8 ABT737与ZM447439对乳腺癌细胞的影响

浓度(μmol/L)T47DG0/G1期S期G2/M期MDA-MB-231G0/G1期S期G2/M期050.9±0.5533.6±0.5914.7±0.3248.5±0.6630.1±0.3015.9±0.530.00152.9±0.4929.7±0.1517.3±0.1537.0±0.4628.8±0.3117.5±0.640.01049.6±0.6420.5±0.2130.8±0.3131.4±0.8020.6±0.8229.9±0.440.10053.2±0.3117.6±0.3136.2±0.1517.3±0.554.6±0.4029.3±0.311.00025.6±0.4216.2±0.1058.2±0.508.8±0.254.2±0.3148.2±0.4910.0009.5±0.204.51±0.5185.8±0.326.1±0.210.1±0.1586.0±0.35

图9 荧光染料显示各组细胞凋亡率(×100)

3 讨 论

Aurora激酶在许多上皮恶性肿瘤中有扩增，与肿瘤形成密切相关，它们在多种肿瘤细胞如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等中过表达〔1〕。AuroraA、B、C是Aurora激酶家族中的3个成员，主要在调节中心体成熟、有丝分裂纺锤体形成、胞质分裂中占有重要的地位。AuroraA已被证实可作为乳腺癌独立的预后因素〔2〕，主要在G2/M期达到高峰，调节细胞周期中G2/M转换，是调节M期进展的关键因子〔3〕，AuroraA通过自身磷酸化发挥作用。研究表明，ZM447439是ATP竞争性结合性小分子Aurora激酶抑制剂，可抑制细胞增殖，抑制HistoneH3磷酸化，细胞出现多倍体现象，胞质分裂失败〔4〕。另外，ZM447439在结肠癌细胞中有抑制肿瘤细胞增殖，阻断微管形成的作用，从而发生细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡〔5〕。

CyclinB1是细胞周期中一种重要的蛋白，使细胞通过G2/M期的检查点，促进细胞G2/M期的转换，它在有丝分裂中后期被降解，促进有丝分裂完成，促使细胞周期的运行。CyclinB1为P-AuroraA的下游基因，在间期开始累积，且越接近有丝分裂期水平越高，CyclinB1可以促使细胞G2/M期的转化〔5〕，因而干扰P-AuroraA形成会影响到G2/M细胞周期的运行，使细胞发生凋亡。Cdc25c在间期存在于胞质中，有丝分裂开始时才转运到核中行使去磷酸化功能。Cdc25c可以将CDK1的Thr14位点(cdc2)去磷酸化从而激活CyclinB/CDK1复合物〔6〕，p21负向调控CyclinB/CDK1，使其发生G2/M期阻滞，Bax能自身形成同源二聚体(Bax/Bax)而诱导凋亡，Bcl-2则可与Bax形成异源二聚体(Bcl-2/Bax)以抑制凋亡，Bax、Bak活化后在线粒体膜上形成二聚体，增加了线粒体外膜通透性，释放出细胞色素C等促凋亡分子，激活Caspase9，再激活下游的Caspase3，导致细胞凋亡〔7〕。

ABT737与Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w有较高亲和力，能促进高表达Bcl-2的肿瘤细胞凋亡。ABT737单药对小细胞肺癌(SCLC)、滤泡性淋巴瘤/弥漫大B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病细胞系最有效，可使小鼠模型异种移植的SCLC完全消失、骨髓瘤生长受抑制〔8〕。对多数肿瘤细胞系，特别是实体肿瘤，单药的细胞杀伤活性较差。ABT737能提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性，与多种化疗药物如依托泊苷、阿糖胞苷、多柔比星、顺铂、紫杉醇等合用时可显著降低这些药物的EC50，减少其副作用〔9〕。本实验发现ABT737还能提高小分子Aurora激酶抑制剂ZM447439的敏感性。

ZM447439抑制AuroraA和HistoneH3的磷酸化，使细胞在G2/M期阻滞，从而抑制乳腺癌细胞的生长〔10〕。ZM447439抑制乳腺癌细胞增殖发生凋亡通过两种途径：(1)抑制P-AuroraA及P-AuroraB的形成。(2)抑制p-Histone H3 形成，形成多倍体细胞和很少部分二倍体细胞，二倍体细胞在药物的作用下随着时间推移最终和多倍体细胞一样形成非整倍体，发生凋亡，从而使促凋亡蛋白Bax表达增加，Bcl-2蛋白表达量减少，ABT737为小分子Bcl-2抑制剂，抑制Bcl-2/Bcl-xl的表达，从而使Bax的表达增加。

ZM447439可抑制乳腺癌细胞AuroraA自身磷酸化，p-cdc25c、p-cdc2表达增加，下调CyclinB1的活性，从而发生G2/M期阻滞，使细胞停滞生长，抑制P-HistoneH3，多倍细胞形成，最终形成非整倍体，细胞发生凋亡，凋亡相关指标发生改变，1 μmol/L ABT737的介入，使促凋亡蛋白表达明显增加，加速乳腺癌细胞发生凋亡。

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