闵 睿

(东北大学医院内科，辽宁 沈阳 110819)

糖尿病肾病(DN)是终末期肾病和糖尿病患者死亡的主要原因，DN的早期表现是肾脏体积增大，肾小球滤过增加，组织学改变是肾小球系膜基质增生，肾小管基底膜增厚等〔1，2〕。到目前为止，发病机制尚不明确，有研究发现转化生长因子(TGF)-β1、趋化因子、各种生长因子、TNF-α等细胞因子介导的炎症机制是DN发生发展的关键〔3，4〕。丹红注射液是一种由丹参、红花等传统中药经科学配方加工而成的复方注射液，中医学认为丹参性寒味苦，为君药；而红花性温味辛，为臣药〔5〕，有活血化瘀，通脉舒络的功效，被广泛应用于心绞痛、脑梗死及冠心病等心脑血管疾病的治疗。研究表明，丹红注射液在药理作用方面有抑制炎症反应的功能〔6〕。本研究通过用丹红注射液干预DN，观察实验动物的肾功能指标及TGF-β1和MMP-2的表达变化，探讨其在DN发生发展过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物造模、分组 48只8周龄雄性SD大鼠购自哈尔滨医科大学实验动物中心，体重200～250 g，鼠龄60～65 d。饲养中自由饮水摄食，饲料为含5%脂肪的普通饲料，SPF级，经辐照灭菌，并且饮用水及垫料均经高压灭菌后使用，每日更换垫料。室温为21℃～23℃，照明时间为12 h。

适应性喂养1 w后，采用随机数字表法抽取12只为正常对照组，其余为糖尿病造模组。造模前称体重，造模组大鼠一次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，用1%柠檬酸盐缓冲液配制成5%的溶液，pH4.5，给药剂量55 mg/kg。正常对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸盐缓冲液。72 h后，尾静脉取血测得空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L，持续3 d为造模成功。将造模成功的糖尿病大鼠随机分成3组，每组12只，分别为糖尿病对照组、丹红注射液干预组及二甲双胍治疗组。其中正常对照组及糖尿病对照组在实验过程中每日腹腔注射蒸馏水2 ml/kg，丹红注射液干预组每日腹腔注射丹红注射液2 ml/kg，二甲双胍治疗组用蒸馏水配制(300 mg/kg)并灌胃。所有组别连续治疗8 w，每周称大鼠体重，于8 w末采集标本。

1.2血、尿标本采集及检测 在第8周末给药后将大鼠放入代谢笼留取24 h尿标本，计算尿量后，3 000 r/min离心10 min，取上清，用全自动生化分析仪(日立，7170A)检测尿蛋白量，采用一点终点法，标本量4 μl，试剂量(尿总蛋白自动分析试剂，randox)240 μl，波长600 nm，反应时间5 min后比色测定。在520 nm波长采用比浊法测定(722分光光度计) 尿肌酐，24 h尿蛋白定量=尿总蛋白/尿肌酐。大鼠禁食8 h后用10%水合氯醛麻醉，从腹主动脉取血液标本，3 000 r/min离心10 min，取血清，均采用全自动生化分析仪(Olmpus，AU2700)检测FPG、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平。取左肾，用10%多聚甲醛固定，待做HE染色及免疫组化。

1.3肾组织HE染色 取8 mm3肾组织用10%中性甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度2.5 μm，脱蜡至水，苏木素染色5 min，蒸馏水洗，1%盐酸乙醇分化，蒸馏水洗，1%氨水反蓝，蒸馏水洗，伊红染色10 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，封片。

1.4免疫组化检测组织中TGF-β1和MMP-2的含量 采用SP法进行染色。将石蜡切片脱蜡至水，用3%H2O2孵育10 min，加入5%的正常山羊血清，室温孵育10 min，倒去血清，与特异性抗体孵育：TGF-β1(1∶50，兔抗人，购自Santa Cruz公司)，MMP-2(1∶100，购自Santa Cruz公司，小鼠抗人)，加完一抗后于4℃冰箱中保存过夜，取出用PBS洗涤3遍，每次5 min，加入二抗后置于37℃孵箱中孵育30 min，然后用PBS洗涤3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记物，37℃孵育30 min，PBS洗涤3次，DAB显色，清水清洗后苏木素复染，清洗，脱水，透明，封片。

1.5RT-PCR检测TGF-β1/MMP-2 mRNA表达 取100 mg肾组织提取总RNA，试剂盒为RNeasy mini tissue kit(Qiagen，USA)，采用碧云天的试剂盒进行反转录得到cDNA，-20℃保存。GAPDH引物为前向(5′-3′)GGACCAGGTTGTCTCCTGTG，反向(5′-3′)ATTCGAGAGAAGGGAGGGCT；TGF-β1前向(5′-3′)TACCAACTACTGCTTCAGCTCCAC，反向(5′-3′)GTTGTGTTGGTTGTAGAGGGCA；MMP-2前向(5′-3′)GAACACAGCCTTCTCTTCCT，反向(5′-3′)GTTTATTTGGCGGACAGTGAC ，95℃ 10 min，95℃ 15 s，40个循环，61℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s；PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，采集图像，用凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司，ChemiDoc MP)对结果进行分析，相对表达量=目的产物/GAPDH的比值。

1.6统计学方法 应用SPSS14.0软件，多组比较采用单因素方差分析，两个时点观测资料采用单因素方差-协方差分析，组间两两比较采用HSD-q检验。

2 结 果

2.1各组血糖和体重比较 考虑到各组0 w数据不尽相同，故以其为协因素进行协方差分析，对8 w数据进行校正。到第8周末，各组大鼠血糖和体重整体差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较并结合主要数据来看，体重指标：3个造模组低于正常对照组，而3个造模组之间差异无统计学意义(P>0.05)；血糖：3个造模组较正常对照组明显升高(P<0.05)，其中二甲双胍治疗组低于糖尿病对照组(P<0.05)，而糖尿病对照组与丹红注射液干预组之间大鼠的血糖差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 实验8 w各组血糖和体重比较

2.2各组血生化指标比较 由整体分析(单因素方差分析)可知：四项生化指标的四组间整体差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较并结合主要数据来看：3个造模组TC、TG较正常对照组明显升高(P<0.05)，其中丹红注射液干预组及二甲双胍治疗组大鼠的TC、TG较糖尿病对照组明显降低(P<0.05)；BUN和SCr水平在各组之间也表现出同样的趋势。见表2。

表2 各组血生化指标比较

2.3各组大鼠24 h尿量及尿蛋白比较 4组间尿量及尿蛋白整体差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较并结合主要数据来看：3个造模组24 h尿量明显高于正常对照组(P<0.05)，但是造模组之间差异多无统计学意义(P>0.05)；尿蛋白较正常对照组明显升高(P<0.05)，其中丹红注射液干预组和二甲双胍治疗组大鼠较糖尿病对照组明显下降(P<0.05)。见表3。

表3 各组24 h尿量、尿蛋白比较

2.4肾组织HE染色 3个造模组大鼠的肾小球肥大增生，还有部分肾小管细胞出现了空泡样变性，肾小囊的囊腔缩小，其中丹红注射液干预组和二甲双胍治疗组肾组织病变程度较糖尿病对照组有改善。见图1。

图1 肾组织HE染色图(×400)

2.5TGF-β1和MMP-2 mRNA水平比较 整体分析4组TGF-β1和MMP-2 mRNA水平差异都有统计学意义(P<0.05)。两两比较并结合主要数据来看：3个造模组肾组织中TGF-β1 mRNA较正常对照组明显增高(P<0.05)，其中丹红注射液干预组及二甲双胍治疗组中TGF-β1表达量相对糖尿病对照组减少(P<0.05)；3个造模组肾组织中的MMP-2水平较正常对照组明显降低(P<0.05)，其中丹红注射液干预组及二甲双胍治疗组MMP-2 mRNA水平相对糖尿病对照组增加(P<0.05)；TGF-β1和MMP-2的表达量在丹红注射液干预组及二甲双胍治疗组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组TGF-β1和MMP-2 mRNA水平比较

2.6免疫组化检测TGF-β1和MMP-2蛋白含量 3个造模组TGF-β1表达强度明显强于正常对照组，其中丹红注射液干预组及二甲双胍治疗组的TGF-β1表达强度相对糖尿病对照组明显减弱，丹红注射液干预组及二甲双胍治疗组之间相近。MMP-2表达强度与TGF-β1相反，3个造模组相对正常对照组表达明显减少，其中丹红注射液干预组与二甲双胍治疗组MMP-2表达强度明显较糖尿病对照组增强，丹红注射液干预组及二甲双胍治疗组之间相近。见图2。

图2 各组TGF-β1和MMP-2蛋白表达的免疫组化图(×400)

3 讨 论

本研究结果发现造模组大鼠的血糖明显升高，并且有多饮、多食、多尿、体重下降等表现，说明造模成功，而丹红注射液在降血糖方面无明显作用。

糖尿病对大鼠的脂代谢有影响，在本研究中，造模组大鼠存在脂代谢异常，而丹红注射液干预组的TC、TG较糖尿病对照组明显降低，提示经丹红注射液治疗后，脂代谢紊乱得到了一定程度的改善，与Li等〔7，8〕相关研究一致。从本研究结果中发现，丹红注射液在糖尿病的进程中能有效保护肾脏功能，但其对肾脏的保护机制还不是十分明确。丹红注射液是一种良好的微循环改善剂，在DN中能减少尿蛋白的排泄，有效延缓DN的发展。丹红注射液在很多疾病的治疗中被发现有抑制IL-6、TNF-α、MCP-1表达的作用，显示其有抗炎性损伤的作用〔9〕。在本研究中，大鼠的血生化指标和肾脏HE染色也验证了这一点，通过PCR和免疫组化实验从两个层面说明丹红注射液有效抑制了TGF-β1的过度表达，但是血糖水平没有明显改善，提示丹红注射液对肾脏的保护作用可能是通过抑制TGF-β1的表达。而TGF-β1在致肾脏纤维化过程中发挥着重要的作用，可刺激胶原蛋白的表达，促进细胞外基质的表达，也可以抑制促纤溶酶原激活物抑制剂的活性，抑制基质金属蛋白酶抑制剂和膜型MMPs的活性，通过这几种途径降低细胞外基质的降解。MMPs在维持肾脏内细胞外基质的生成与降解平衡中发挥着关键的作用〔10,11〕，其中MMP-2可以降解细胞外基质的主要成分Ⅳ型胶原〔12〕。在本研究中，丹红注射液可以促进MMP-2表达，从而减少细胞外基质在肾小球系膜区沉积，减轻肾小球的硬化程度。

综上所述，本研究发现DN的发生发展可能与TGF-β1过度表达和MMP-2表达降低有关，并且丹红注射液可以通过抑制TGF-β1和促进MMP-2表达改善糖尿病大鼠肾功能。

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