董礼全 孙海荣 王鹏飞 仲伟斌 高 犇 潘旭东

(威海市立医院神经内科，山东 威海 264200)

脑梗死是一种不同分型的临床综合征，发病过程中伴有炎性免疫反应。有报道在急性梗死动物的血液、脑组织病理中可见炎性免疫细胞异常反应〔1，2〕。本研究分析老年脑梗死急性期患者动脉硬化斑块、动脉狭窄及微栓子信号(MES)、调节性T细胞(Treg)、载脂蛋白(Apo)A1和脂蛋白磷脂酶(Lp-PL)A2的表达水平。

1 对象与方法

1.1对象 2012年10月至2015年1月青岛大学附属医院神经内科住院老年脑梗死患者222例，其中男121例，女101例，年龄61～95岁，平均(69±5)岁，符合第四届全国脑血管病学术会议诊断表标准，病情允许且能配合检查。对照组为我院同期查体者146例，其中男76例，女70例，年龄61～85岁，平均(65±4)岁。排除标准：①伴肿瘤、免疫病、血液病、急性感染疾病者；②脑梗死后遗症病史或近2 w服用抗血小板聚集、降脂药者；③房颤及心脏超声证实有心源性栓子来源患者；④脑出血患者；⑤近4 w有外伤史或外科手术史；⑥近2 w服用中药汤剂者；⑦最近3个月参加过或者正在参加其他临床研究者。

1.2动脉病变检测 采用德利凯(EMS-9EBX2P)型超声诊断仪，发病1 w内完成检测，探测显示颈内动脉起始至大脑中动脉M1段，观察有无斑块，测量管腔内中膜厚度、管腔管径。判断标准：颈动脉内中膜增厚>1.0 mm为增厚；管腔内中膜局部增厚>1.2 mm粥样硬化斑块形成。斑块分为以下4种：(1)较均的低回声脂质型软斑块；(2)等回声的纤维型斑块；(3)强回声或伴声影的钙化型硬斑块；(4)回声不均的溃疡型混合斑块。软斑块及混合斑块为不稳定斑块，纤维斑块及钙化型硬斑块为稳定斑块。管腔狭窄程度：轻中度狭窄(<70%)；重度狭窄≥70%。

1.3MES的识别 采用德利凯(EMS-9EBX2P)型超声诊断仪，发病1 w内完成MES检测，患者取安静仰卧位，2 MHz探头取得症状侧大脑中动脉清晰信号，固定Spencer头架，深度50～60 mm，两点间距大于6 mm，取样容积为6～12 mm，由2名神经内科医师共同检测，检测完毕回放每个微栓子信号，除外伪差和干扰，采用1995年第9届国际脑血液循环会议制定的标准，①时程短暂，持续时间<300 ms；②强度较背景血流信号≥3 dB;③单向出现于多普勒频谱中；④音频信现为“劈啪音”或“鸟鸣声”；⑤在心动周期内随机出现；⑥在2个监测深度存在时间延迟。检测时间60 min，将监测结果MES≥1者入选阳性组。

1.4Treg和ApoA1检测 患者在入院次日清晨空腹肘静脉采血2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，6 h内流式细胞术检测。EPICS XL-4型流式细胞仪进口于美国贝克曼公司，Optilyse C溶血素，小鼠抗人荧光单抗CD25-FITC、CD4-PE-Cy5及同型对照进口于法国Immunotech公司。小鼠抗人荧光单抗CD95-PE及同型对照购于晶美生物公司。抗体组合为CD25-FITC、CD95-PE、CD4-PE-Cy5。CD4+CD25+Treg中CD25表达荧光强度>100者为CD4+CD25highTreg。以FS-SS设门分析外周血Treg和CD95/ApoA1的表达。见图1。

1.5Lp-PLA2检测 患者在入院次日清晨空腹肘静脉采血2 ml，EDTA抗凝，1 500 r/min离心10 min，收集上清液，-70℃保存，应用中美合资天津康尔克生物科技有限公司试剂盒，固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)，175 ng/ml以下为正常。

1.6统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行χ2、t检验。

图1 流式细胞检测图

2 结 果

脑梗死组MES阳性率、ApoA1、Lp-PLA2水平显著高于对照组，Treg水平显著低于对照组(P<0.05)。不稳定斑块组MES阳性率显著高于非不稳定斑块组和对照组，Treg显著低于非不稳定斑块组和对照组，ApoA1显著高于非不稳定斑块组和对照组，Lp-PLA2显著高于非不稳定斑块组和对照组(均P<0.05)。重度狭窄组MES阳性率显著高于非重度狭窄组和对照组，Treg显著低于对照组，ApoA1显著高于对照组，Lp-PLA2显著高于非重度狭窄组和对照组(均P<0.05)。MES阳性组Treg显著低于MES阴性组和对照组，ApoA1显著高于MES阴性组和对照组，Lp-PLA2显著高于MES阴性组和对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组 MES、Treg、ApoA1、Lp-PLA2的检测

与对照组比较：1)P<0.05；与非不稳定斑块组比较：2)P<0.05;与非重度狭窄组比较：3)P<0.05；与MES阴性组比较：4)P<0.05

3 讨 论

脑梗死是由多种病因所引起的脑细胞缺血坏死，老年脑梗死病因包括年龄、高血压、糖尿病、吸烟、高脂血症、家族遗传等有关，部分患者病因不明，其中动脉粥样硬化仍然是老年脑梗死的主要病理改变，可表现为动脉内膜增厚、斑块形成、动脉狭窄等〔3，4〕，患者动脉硬化斑块好发于颈内动脉虹吸段、颈动脉分叉处等，斑块的大小关乎动脉腔的通畅，斑块纤维膜是否破溃关乎是否形成附壁血栓，斑块是否稳定关乎是否出现斑块脱落而引起的栓塞，进而可出现脑梗死。MES是脑梗死危险因素〔5〕，欧洲脑卒中组织(ESO)指出经颅多普勒(TCD)是监测脑血流中MES的唯一方法〔6〕。Treg在维持人体正常免疫耐受中发挥重要的作用〔7，8〕，其在脑梗死急性期间的具体作用机制尚不明确，近来研究表明，只有高表达CD25的Treg在免疫抑制功能方面更具代表性。ApoA1为凋亡因子〔9〕，其属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族。脑梗死急性期大量脑细胞死亡，继而大量胶质细胞增殖，凋亡伴随在脑梗死全过程〔10〕，Lp-PLA2是一种新的炎症标记物，具有促炎症的作用，Lp-PLA2在破裂动脉粥样斑块中凋亡的巨噬细胞高聚集区中高度表达〔11，12〕。

动脉粥样硬化不可避免地伴随在人类的生命之中，颈部动脉粥样硬化是全身动脉粥样硬化的缩影，可在局部表现为形成斑块，斑块也可随年龄增加而增大，可能因为治疗而稳定或逆转。斑块的性状受多种因素影响，一般年龄、男性、吸烟、高血压、糖尿病及高脂血症等是斑块形成的常见因素〔13〕。有些斑块可短期内增大明显，斑块内粥样物质短期内增多，纤维帽相对变薄，一旦破溃，则斑块表面容易形成血小板、红细胞等聚集，在局部形成新的血栓或者脱落后形成栓子。本研究发现在急性期不稳定斑块患者外周血ApoA1 升高，Treg降低，提示免疫耐受受到抑制，细胞凋亡增速，可能与斑块内皮细胞、泡沫细胞和梗死的脑细胞有关。Tsimikas等〔14〕认为Lp-PLA2是识别脑卒中风险的预警因子，与本文结果一致。

脑血供分为全循环和后循环，一般约有4/5的脑血供来自前循环，颈内动脉狭窄则引起血供减少，为了满足脑血供被迫经基底动脉环等代偿，可引起前循环盗血、代偿性血压增高，心脏负担代偿增加，灌注不足引起前后循环缺血，后循环过度灌注诱发后循环脑出血等风险〔15〕，动脉粥样硬化斑块体积的扩增是导致颈动脉管腔狭窄最常见的病因。如果不稳定斑块破溃，表面聚集形成血栓，也可短时间引起管腔狭窄或闭塞。颈动脉狭窄常位于颈内外动脉分叉段、虹吸部及颈内动脉末段〔16〕。这些部位发生血流动力学改变，血流对动脉内膜冲击大，容易形成内皮损伤和湍流，长期颈动脉狭窄可引起智能下降〔17〕。本研究提示狭窄部位有利于MES形成。脑梗死预警因子Lp-PLA2水平高，可能与狭窄部位血管内皮损伤有关，大部分颈动脉狭窄慢性进展形成，即便是在发生急性脑梗死时，炎症免疫反应也相对较轻。

TCD可以检测到的血流中通过的微小颗粒信号称为MES，这些小颗粒多为微小血栓碎片等〔18〕。脑血流中MES的发现加深了对脑梗死发病机制的理解，特别是脑栓塞机制有了直观的证据，MES对缺血性脑卒中有预警有作用，MES减少是有疗效的依据〔19〕。本研究说明MES阳性患者体内明显的存在炎性免疫反应，Treg 降低提示患者免疫耐受不稳，出现了急性免疫反应，ApoA1升高可能与微小栓子栓塞引起脑细胞坏死有关，尽管这种栓塞在目前的弥散加权成像(DWI)也不能完全可视，但确实存在。Lp-PLA2水平高提示血管内皮炎症较重，也是MES大部分来源于受损的动脉内膜的侧面证据。患者多来源于主动脉弓以上的前循环系统，如果在颈动脉未发现栓子来源则提示临床应该向下寻找如心脏和主动脉弓甚至下肢动脉病变。

综上，脑梗死是一类血栓病变，是一类血管壁病变，也是一类炎症免疫病变。脑梗死急性期对上述指标检测有利于合理判断病情，对充分理解发病机制有帮助，对抗血小板聚集、调制稳定板块抗炎等治疗的强度和疗程有指导意义，对个体化诊治有促进作用。

1Lee JH，Kwon KY，Yoon SY，etal. Characteristics of platelet indices，neutrophil-to-lymphocyte ratio and erythrocyte sedimentation rate compared with C reactive protein in patients with cerebral infarction：a retrospective analysis of comparing haematological parameters and C reactive protein〔J〕.BMJ Open，2014；4(11):e006275.

2Garcia JH，Liu KF，Ho KL. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex〔J〕. Stroke，1995;26(4):636-43.

3Kobayashi A，Wardlaw JM.Oxfordshire community stroke project clinical stroke syndrome and appearances of tissue and vascular lesions on pretreatment CT in hyperacute ischemic stroke among the first 510 patients in the third international stroke trial (IST-3)〔J〕. Stroke，2009；40(3)：743-8.

4Kinsella JA，Tobin WO，Kavanagh GF，etal. Increased thrombin generation potential in symptomatic versus asymptomatic moderate or severe carotid stenosis and relationship with cerebral microemboli〔J〕. J Neurol Neurosurg Psychiatry，2015；86(4)：460-7.

5Müller HF，Viaccoz A，Fisch L，etal.18FDG-PET-CT：an imaging biomarker of high-risk carotid plaques. Correlation to symptoms and microembolic signals〔J〕. Stroke,2014；45(12)：3561-6.

6Jeong HS，Song HJ，Lee JH，etal. Interpretation of TCD spectral patterns detected during carotid artery stent interventions〔J〕. J Endovasc Therapy，2011；18(4)：518-26.

7Wang WJ，Liu FJ，Liu X，etal. Adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+regulatory T cells reverses the increase in abortion rate caused by interleukin 17 in the CBA/JxBALB/c mouse mode〔J〕. Hum Reprod，2014；29(5)：946-52.

8Dennis B，Gower L，Emanuela I，etal. Mast cells suppress murine GVHD in a mechanism independent of CD4+CD25+regulatory T cells〔J〕. Blood，2013；122(22)：3659-65.

9Fortner KA，Rosemary K. Fas (CD95/APO-1) limits the expansion of T lymphocytes in an environment of limited T-cell antigen receptor/MHC contacts〔J〕. Int Immunol，2011；23(2)：75-88.

10Fortner KA,Budd RC. The death receptor Fas (CD95/APO-1) mediates the deletion of T lymphocytes undergoing homeostatic proliferation〔J〕. J Immunol，2005；175(7)：4374-82.

11Matter CM，Chadjichristos CE,Meier P,etal. Role of endogenous Fas (CD95/Apo-1) ligand in balloon-induced apoptosis，inflammation，and neointima formation〔J〕. Circulation，2006；113(15)：1879-87.

12Wang T，Karino K，Yamasaki M,etal. Effects of G994T in the Lp-PLA2 gene on the plasma oxidized LDL level and carotid intima-media thickness in Japanese：the Shimane Study〔J〕.Am J Hypertens，2009；22(7)：742-7.

13邵 红，谢立凯，吕 丹.2型糖尿病患者血糖波动与颈动脉粥样硬化斑块的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2013；31(12)：4518-20.

14Tsimikas S，Mallat Z，Talmud PJ，etal. Elevated oxidized phospholipids on apolipoprotein B-100 particles predict 6-year cardiovascular events in the Epic-Norfolk Study：potentiation of risk with lipoprotein-associated (Lp-PLA2) and soluble phospholipase A2 (sPLA2) activity〔J〕. Circulation，2008；10:118-23.

15Sharma VK，Paliwal PR，Sinha AK. Plaque inflammation imaging in severe carotid stenosis and recurrent cerebral ischemia〔J〕.J Nucl Med Technol，2015;43(4):299-300.

16董礼全.MES与CD4+CD25+Treg等指标的研究〔D〕.青岛：青岛大学，2016.

17向 静.老年认知功能障碍与颈动脉硬化及相关基因多态性研究〔D〕.重庆：第三军医大学，2013.

18Wang HJ，Kim SJ，Hong JM，etal. Microembolic signals in acute posterior circulation cerebral ischemia：sources and consequences〔J〕. Stroke，2012；43(4)：747-52.

19Al-Atassi T,Lam K,Forgie M,etal. Cerebral microembolization after bioprosthetic aortic valve replacement：comparison of Warfarin plus aspirin versus aspirin only〔J〕. Circulation，2012；126(11 suppl 1)：S239-44.