赵宇红 陈 旺 曾 宇

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

阿尔茨海默病(AD)以不可溶性β淀粉样肽沉积引起神经元的毒性损伤得到较多的研究支持〔1〕。内质网(ER)是细胞内蛋白修饰及处理的场所，未折叠蛋白的蓄积可引起具有保护作用的内质网应激(ERS)，帮助细胞渡过难关，维持细胞生存，但长期过强的ERS或其应激机制的失常将诱导细胞的损伤及凋亡〔2,3〕。研究发现，缺氧、氧化应激、异常糖基化反应、钙离子稳态的异常都可导致ERS反应造成细胞的损伤〔4,5〕。研究表明，不可溶性β淀粉样肽沉积也可引发神经细胞ERS，参与神经退行性疾病如AD的病理生理过程，是诱导神经细胞凋亡的重要因素〔6～8〕。芹黄素具有抗氧化、抗感染、抗肿瘤等作用〔9～11〕，本课题组前期的实验研究发现，芹黄素对AD细胞及动物模型有较好的改善作用，也可以诱导抗凋亡基因的表达〔12,13〕，但芹黄素是否对参与神经退行性病变发生的ERS途径影响，目前报道较少。本研究观察芹黄素对神经细胞ERS凋亡途径的调节作用。

1 资料与方法

1.1主要试剂及仪器 布雷菲德菌素(BF)A购自(Cell Signaling Technology,美国)，兔抗大鼠微管关联蛋白(MAP)2多克隆抗体，羊抗大鼠葡萄糖调节蛋白(GRP)78及兔抗大鼠C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)多克隆抗体(SantaCruz,美国)，Annexin V-FITC凋亡试剂盒(BD)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒(Pierce,美国)，RT-PCR试剂盒(Fermentas，美国),神经生长因子(NGF)购自武汉海特生物工程公司，芹黄素购自静琳科工贸有限公司，其他试剂均购自北京鼎国生物科技公司，流式细胞仪(FACScalibur)，PCR仪及酶标仪(Bio-RAD,美国)。

1.2细胞培养、诱导分化及鉴定 PC12细胞按1×105个细胞/ml浓度接种于培养板或培养瓶中，在10%小牛血清的DMEM培养液(Gibco,美国)，5%CO2,37℃的培养箱中培养，按文献方法〔14〕加入NGF 50 μg/L培养7d，镜下观察PC12细胞长出长突起，去上清，用0.25%胰酶消化后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，1 000 r/min离心10 min,收集细胞，用流式细胞测定细胞微管关联蛋白(MAP)2及神经元烯醇化酶(NSE)表达。

1.3药物处理及分组 细胞培养用不同浓度的BFA处理48 h，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并选取BFA 1 μg/ml作为模型组处理剂量。实验分为对照组、模型组、芹黄素(10.00、20.00、40.00 μmol/L)组。对照组不加BFA，模型组给予BFA 1 μg/ml作用48 h，芹黄素(10.00、20.00、40.00 μmol/L)组在给予BFA前先用芹黄素10.00、20.00、40.00 μmol/L分别孵育12 h(对照组给予生理盐水)。各组实验终止后，同前法收集细胞进行实验指标测定。

1.4流式细胞仪检测 收集的细胞用PBS重悬，加入C5标记的兔抗MAP2一抗(1∶10 000)暗室孵育1 h，1 000 r/min离心10 min，PBS洗3次，上流式细胞仪测定MAP2阳性细胞比例。同上法，按Annexin V-FITC凋亡试剂盒说明操作，测定凋亡细胞阳性率。

1.5MTT测定细胞存活率 接种于96孔板内的细胞，按以上各组处理后，吸出培养液，每孔加入不含血清培养基180 μl和5.0 g/L MTT 20 μl,于37℃孵育4 h后吸出，每孔加入DMSO 200 μl，37℃孵育0.5 h，在酶标仪上读取560/630 nm处的吸光度值。

1.6RT-PCR 检测GRP78及CHOP mRNA的表达 收集对照组、模型组、10.00、20.00 μmol/L芹黄素细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，按RT-PCR试剂盒方法操作测定GRP78及CHOP mRNA的表达。RT-PCR引物由大连宝生物有限公司设计合成，引物序列如下：GRP78 上游引物 5′GACCATGGAGAAAGCTGTAGAGGAA-3,下游引物为5′CCAAGACACGTGAGCAACTGCTA-3;退火温度62℃,373 bp,CHOP上游引物5′-CTTTCGCCTTTGAGACAGTGTCCAG-3′，下游引物5′-CCATAGAACTCTGACTGGAATCTGGAG-3′，退火温度60℃,223 bp；β-actin:上游引物5-GAGCACCCTGTGCTGCTCACCCGAGG-3′下游引物5′-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCCACGCT-3,退火温度65℃,300 bp。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，扫描后，用imageJ图像软件处理。

1.7Western印迹检测GRP78及CHOP蛋白表达 收集对照组、模型组、10.00、20.00 μmol/L芹黄素细胞提取总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白浓度测定，各组调整为相同浓度后，加入上样缓冲液， 100℃水浴加热5 min，样品冷却后于4℃下在12.5% SDS-聚丙烯凝胶上电泳，每孔上样量为10 μl,以Marker为参考，切取目的条带蛋白转于NC膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入抗GRP78(1∶1 000)，抗CHOP(1∶1 000)和抗β-actin(1∶1 000)抗体，4℃冰箱过夜，取出，TBS洗10 min×2次，加入相应荧光二抗，37℃孵育1 h,TBS洗10 min×2次,免疫信号用增强型化学发光法显色，曝光到X 线胶片上。将X 线胶片扫描后，用ImageJ1.41 分析软件进行灰度分析。

1.8统计学处理 采用SPSS16.0软件进行LSD及χ2检验。

2 结 果

2.1NGF诱导神经元样PC12细胞鉴定 倒置显微镜可见PC12细胞突起明显变长，细胞呈现三角形，贴壁生长，具有神经元样形态。MAP2平均阳性率为(94.78±3.60)%,显示PC12细胞经诱导后具神经元样特性。

2.2不同浓度BFA对神经元样PC12细胞凋亡的影响 BFA在0.05，0.10,0.50,1.00,5.00，10.00 μmol/L的浓度范围内可呈剂量依赖性抑制神经元样PC12细胞凋亡,随BFA浓度增大，细胞凋亡率增加，各组细胞存活率分别为(92.26±3.48)%、(72.62±6.70)%、(61.33±4.63)%、(32.54±6.50)%、(28.18±3.18)%、(3.96±2.02)%，为实验方便，我们选取BFA 1.00 μg/ml(即0.283 μmol/L)作为诱导凋亡剂量。

2.3芹黄素对BFA诱导的神经元样PC12细胞存活率的影响 用芹黄素10.00、20.00、40.00 μmol/L预处理经BFA诱导凋亡的神经元样PC12细胞后，细胞存活率分别为(48.72±4.07)%、(60.65±4.80)%及(63.20±5.18)%，与对照组(100.00±2.46)%差异无统计学意义(P值分别为2、62、3.71、3.86)，表明芹黄素对细胞无毒性损伤；但与模型组〔(32.19±2.91)%〕比较差异有统计学意义(P值分别为0.013、0.022、0.031)，表明细胞的存活率提高比较明显。

2.4芹黄素对GRP78、CHOP mRNA表达的影响 如表1所示，与对照组GRP72、CHOP mRNA比较，BFA可诱导细胞GRP78、CHOP mRNA表达增加，10.00、20.00 μmol/L的芹黄素预处理均可明显减少细胞GRP78、CHOP mRNA的表达。

表1 芹黄素对GRP78、CHOP mRNA表达的影响

与模型组比较：1)P<0.05，下表同

2.5芹黄素对GRP78、CHOP 蛋白表达的影响 BFA可诱导细胞GRP78、CHOP 蛋白表达增加，10.00、20.00 μmol/L的芹黄素预处理均可明显减少细胞GRP78、CHOP 蛋白的表达，见表2。

表2 芹黄素对GRP78、CHOP蛋白表达的影响

3 讨 论

ERS在神经退行性疾病发生中的作用渐受关注〔15～17〕。PC12细胞具有神经内分泌细胞的特性，但其蛋白表达与神经元存在差异性〔18〕。但在NGF诱导后，PC12细胞即出现蛋白表达的变化，用NGF诱导7 d，PC12细胞的形态学变化不可逆，具有神经元样功能〔19，20〕。本文与上述研究结果一致。BFA是一种天然存在的大环内酯类抗生素，它能特异性地阻断蛋白质从ER向高尔基体复合物转运过程，引起ER蛋白质处理的障碍，诱导ERS的发生，引起细胞凋亡〔21〕，本实验表明ERS模型的建立，与文献报道结果相同〔22～24〕。GRP78表达上调具有ERS特异性,常被用作ERS 的标志性分子〔25，26〕。本实验观察发现，用芹黄素处理PC12分化细胞，可降低由BFA诱导的GRP78 高表达，提示芹黄素可减轻ERS反应，可用作抑制ERS损伤的有效药物。芹黄素化学名为4′,5,7-三羟基黄酮，属黄酮类化合物， 研究发现，某些黄酮类成分可通过降低GRP78表达，减轻ERS严重程度，减轻滑膜炎症损伤及缺血心肌再灌注损伤，产生保护作用〔27～29〕。ERS发生后，细胞将存亡决定于细胞内稳态的维持; 若细胞内稳态遭到破坏，未折叠蛋白反应(UPR)将作为凋亡的执行者，去除组织中的损伤细胞。因此CHOP被认为是ERS凋亡途径信号途径中最重要的成员〔30,31〕。本实验表明芹黄素可通过抑制ERS诱导的DNA损伤相关基因表达,抑制由ERS诱导的凋亡途径，产生细胞保护作用。

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