李宏伟 徐 凯 付金芳 魏永鸽

(黄河科技学院，河南 郑州 450063)

前列腺癌早期缺乏特异性的临床症状和体征，很多患者被确诊时已处于中晚期，延误了治疗的最佳时机〔1〕。桥粒芯糖蛋白(DSG)是桥粒的主要跨膜蛋白，其中DSG2表达水平下降可能参与了角质形成细胞的分化，并在肿瘤的发生过程中有重要作用。有研究证实〔2〕，DSG2在表皮肿瘤中呈低水平表达。E-钙黏蛋白(E-cadherin)是钙黏附蛋白家族中重要的细胞间黏附分子，研究表明〔3〕，E-cadherin编码基因(CDH1基因)发生突变使E-cadherin表达水平下降，继而通过复杂的病理机制增加恶性肿瘤的易感性而参与恶性肿瘤的发生发展。Akt又称蛋白激酶B，是恶性肿瘤患者组织中常见的超活化激酶，对恶性肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭等有重要调节作用，磷酸化Akt(pAkt)是Akt发挥功能的重要形式。研究显示〔4〕，pAkt在胃癌组织中呈高表达，推测可能参与了胃癌的发生发展过程。本研究通过检测DSG2、E-cadherin、pAkt在前列腺癌组织中的表达情况，旨在探讨三者在前列腺癌发生发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年9月至2016年9月黄河科技学院附属医院收治的117例经病理组织学检查证实为前列腺癌的患者为前列腺癌组，纳入标准：术前未行任何放、化疗治疗者，排除标准：心、肝、肾功能障碍者。年龄47～83岁，平均(69.2±8.5)岁；确诊时前列腺特异性抗原(PSA)含量2.4～19.8 ng/ml，平均(8.2±3.4)ng/ml；Gleason评分分级〔5〕：高分化(2～6分)75例，中、低分化(7～10分)42例；TNM分期〔6〕：Ⅰ期29例，Ⅱ期53例，Ⅲ期30例，Ⅳ期5例；有转移者39例，无转移者78例。于同期选取100例良性前列腺增生患者作为良性病变组，年龄43～81岁，平均(67.5±7.4)岁；收集组织标本时的PSA含量0.3～5.7 ng/ml，平均(1.1±0.8)ng/ml。同时随机选取30例黄河科技学院附属医院体检的健康志愿者为对照组，年龄47～75岁，平均(68.3±8.7)岁；收集组织标本时的PSA含量0～0.6 ng/ml，平均(0.2±0.1)ng/ml。研究过程取得医院伦理委员会的同意。

1.2方法 组织标本均以10%中性甲醛进行固定，石蜡包埋后采用组织芯片制备仪制备成为芯片；将每个组织制备成HE切片，并在显微镜下定位典型病变部位，并标记相关的区域然后将其与石蜡组织标本比较，确定标记部位在石蜡组织的同一部位后也进行标记；制作空白的蜡块，大小为长36 mm×宽26 mm×高15 mm，在空白蜡块25 mm×21 mm的范围内打一个1.5 mm的孔，以制作108(12×9)点阵芯片模块；在空白蜡块的小孔内放入标记好的目标组织，每一例标本均进行编号，在空载体芯片蜡块中，从第1排的第3个小孔开始，按照序号依次将所有的标本种植在空白的蜡块中，然后通过石蜡切片机连续切片。

将制备好的组织芯片4 μm的石蜡切片在58℃下烤18 h，然后常规脱蜡并磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍，然后再用柠檬酸缓冲液抗原对其进行修复，持续时间20 min后室温下冷却20 min，再以PBS清洗3遍，将20%的蛋清滴至石蜡切片后置于室温下30 min；然后加入混合物(1∶50的鼠DSG2或者E-cadherin或者pAkt和1∶100的CK8/18)后在室温环境中孵育4 h，并以PBS清洗3遍，再加混合物(1∶30的羊抗鼠IgG-FITC和1∶100的生物素羊抗兔IgG)，在室温环境中避光孵育1 h，再以PBS清洗3遍，加入Streptavidin.Cy3后在室温环境下孵育1 h，以PBS清洗3遍，后以蒸馏水清洗3遍，并通过防荧光碎灭剂进行封片；在LeicaTCS SP2激光扫描共聚显微镜下进行扫描，然后通过计算机采集数据处理后数字成像。

1.3评价方法 染色的细胞核中有红色的荧光则计为DSG2、E-cadherin、pAkt阳性；发生免疫反应的肿瘤细胞与组织核的比值即为蛋白的表达计算方法。

2 结 果

2.1三组DSG2、E-cadherin、pAkt表达水平比较 三组研究对象的DSG2、E-cadherin、pAkt表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较，前列腺癌组、良性病变组中DSG2、E-cadherin的表达水平低于对照组、pAkt表达水平高于对照组，并且前列腺癌组中DSG2、E-cadherin的表达水平低于良性病变组、pAkt表达水平高于良性病变组(P<0.05)。见表1。

表1 三组DSG2、E-cadherin、pAkt水平比较

与对照组比较：1)P<0.05；与良性病变组比较：2)P<0.05

2.2DSG2、E-cadherin、pAkt表达水平与前列腺癌临床病理特征的关系 PSA≥8 ng/ml的前列腺癌患者组织中DSG2、E-cadherin表达水平显著低于PSA<8 ng/ml的患者，pAkt表达水平显著高于PSA<8 ng/ml的患者，TNM Ⅲ～Ⅳ期的前列腺癌患者组织中的DSG2、E-cadherin表达水平显著低于Ⅰ～Ⅱ期患者，有转移的前列腺癌患者组织中DSG2、E-cadherin表达水平显著低于无转移者，pAkt表达水平显著高于无转移者(P<0.05)。见表2。

2.3DSG2、E-cadherin、pAkt之间的相关性 DSG2与E-cadherin呈正相关关系(r=0.659，P<0.05)，DSG2、E-cadherin与pAkt均呈负相关(r=-0.739、-0.682，P<0.05)。见图1～图3。

表2 DSG2、E-cadherin、pAkt表达水平与前列腺癌临床病理特征的关系

图1 DSG2与E-cadherin的相关性

图2 DSG2与pAkt的相关性

图3 E-cadherin与pAkt的相关性

3 讨 论

PSA是临床筛查和诊断前列腺癌、评估预后的重要肿瘤标志物，但有报道显示〔7〕，前列腺炎以及良性前列腺增生等均可导致PSA水平升高。有学者〔8〕研究发现当PSA≥20 ng/ml时，在良性前列腺疾病、前列腺癌患者中所占的比例分别为41.53%、58.47%。可见，仅采用PSA诊断前列腺癌极有可能造成误诊和漏诊，从而延误病情的治疗。

DSG作为一种糖蛋白，是构成细胞间桥粒的主要成分，主要有3种基因型，DSG1在正常的表皮细胞上部表达，而DSG3则主要表达于正常的表皮细胞下部，DSG2主要表达于基底细胞层。研究发现〔9〕，DSG2的表达发生障碍可引起桥粒的破坏，继而参与多种表皮恶性肿瘤的发生发展过程。关于DSG2在恶性肿瘤发病机制中的作用，现有研究主要集中在天疱疮等表皮恶性肿瘤中〔10〕，对DSG2在其他恶性肿瘤中表达的研究报道相对较少。E-cadherin是介导Ca2+依赖的细胞和细胞间黏附的钙黏蛋白家族成员，E-cadherin在上皮细胞表面广泛表达，通过介导Ca2+依赖细胞黏附可维持正常上皮细胞的极性，调控细胞生长〔11〕。病理学结果显示〔12〕，E-cadherin介导的Ca2+依赖细胞黏附可抑制肿瘤细胞的侵袭、转移等，即当细胞之间的黏附能力增强可引起肿瘤细胞的侵袭和转移能力下降，反之则使肿瘤细胞脱离原发的病灶部位并侵袭转移至其他部位。研究显示〔13～15〕，E-cadherin在胃癌、乳腺癌及前列腺癌组织中的表达明显减少，其可能介导了恶性肿瘤的发生发展过程。pAkt有三种哺乳动物Akt亚型，分为Akt1、Akt2以及Akt3，其中Akt1亚型与Akt2和Akt3的相同点约为82%，每一个亚型分别有激酶区、血小板蛋白同源区以及羧基端调节区。Akt被磷酸化后将从膜上分离，进而磷酸化细胞膜以及细胞核内的靶目标。有研究显示〔16〕，Akt过度表达通过调节不同类型下游底物而促进恶性肿瘤细胞的增殖、并抑制其凋亡。

本研究结果显示，DSG2、E-cadherin表达下调，pAkt表达上调而参与前列腺癌的发生过程。此外，DSG2、E-cadherin、pAkt与PSA水平、临床病理分期以及有无转移密切相关，PSA水平越高、临床分期越高以及前列腺癌转移患者的DSG2、E-cadherin表达水平更低，pAkt表达水平更高。提示DSG2、E-cadherin、pAkt参与了前列腺癌的发生发展过程，联合检测DSG2、E-cadherin、pAkt可评估前列腺癌患者的病情及预后。进一步分析DSG2、E-cadherin、pAkt之间的相关性，结果显示DSG2与E-cadherin呈正相关关系，DSG2、E-cadherin与pAkt均呈负相关关系，提示DSG2、E-cadherin、pAkt通过相互作用共同参与了前列腺癌的发生过程。

综上所述，前列腺癌患者组织中DSG2、E-cadherin表达水平上调，pAkt表达水平下调，三者相互作用共同参与了前列腺癌的发生过程，联合检测可评估前列腺癌的病情及预后，临床有重要的参考价值。

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