郭金刚 类承斌

【摘要】 目的：探讨U0126对急性白血病细胞HL-60增殖与凋亡的影响。方法：用不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126处理HL-60细胞24、48、72 h，MTT法检测细胞活力，Hoechst染色检测细胞形态，EdU染色检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，Western blot检测细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）、生存素（Survivin）、p21和p27表达及细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）磷酸化水平。

结果：5、10、20 μmol/L的U0126处理HL-60细胞24、48、72 h，能显著提高细胞增殖抑制率（P<0.01），具有时间与剂量依赖性（r=0.421、0.478）。与0 μmol/L比较，5、10、20 μmol/L的U0126能使细胞核发白，致密浓染，细胞增殖率降低（P<0.01），细胞周期阻滞在G1期（P<0.01），PCNA、Survivin及p-ERK1/2表达均下调（P<0.01），p21与p27表达均上调（P<0.01）。结论：U0126能显著抑制白血病细胞HL-60增殖，诱导细胞凋亡。

【关键词】 U0126； 急性白血病； HL-60； 增殖； 凋亡

急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种源自造血干细胞恶性克隆的血液肿瘤，是急性白血病中的一种，约占80%。近年来随着化疗、放疗、干细胞技术的不断进步，AML的治愈率大大提高，但患者的5年生存率仍不到50%[1-2]。因此进一步探讨AML的发病机制、寻找新的治疗方法具有重要意义。AML的发生发展与众多信号通路密切相关，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kanase，MAPKs）信号通路就是其中一种，此信号通过三级酶促反应将上游信号传递到细胞核，引起一连串生物反應[3-4]。1，4-二氨基-2，3-氰基-1，4-双[2-氨基苯基硫代]丁二烯（U0126）是该信号通路特异、高效的抑制剂，能够通过抑制MEK活性，阻断ERK的磷酸化及信号传递[3-4]。有研究显示，MAPK信号通路成员在白血病中被高度激活，而U0126能显著抑制黑色素瘤细胞、肺癌细胞、舌鳞癌细胞、胶质瘤细胞的增殖[5-7]，但U0126在急性白血病中的作用机制尚未见报道。因此本研究将探讨U0126对急性白血病HL-60细胞增殖与凋亡的影响及相关机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 兔抗人PCNA、Survivin、p21、p27、GAPDH单克隆抗体均购自美国Cell Signal Technology公司；兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗体均购自美国Abcam公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、DMEM培养基均购自美国Gibco公司；U0126、Hoechst染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自南通碧云天生物技术有限公司，细胞周期检测试剂盒南京凯基生物技术有限公司；EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司。DMI4000B倒置荧光显微镜购自德国莱卡公司；DYCZ-25D型双垂直电泳仪、DYCZ-25D型转印电泳仪均购自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；MK3酶标仪购自美国thermo公司。

1.2 细胞株 人早幼粒白血病细胞HL-60购于中国科学院细胞库，培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在细胞密度达到80%时候以1︰3的比例传代，选取对数生长期的细胞用于后续的实验研究。

1.3 方法

1.3.1 MTT法检测HL-60细胞活力 将5×103个HL-60细胞接种到6孔板，培养24 h后，用不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126处理HL-60细胞24、48、72 h，加入20 μL的MTT孵育4 h，将96孔板中翻转过来弃去上清液，再每孔加入150 μL的二甲基亚砜，于微量振荡器震荡使结晶物溶解，在酶标仪波长560 nm处测OD值，细胞增殖抑制率（%）=（U0126组OD值-空白组OD值）/（control组OD值-空白组OD值×100%。

1.3.2 Hoechst染色检测HL-60细胞形态 将8×103个HL-60细胞接种到6孔板，培养24 h后，用不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126处理HL-60细胞48 h，PBS洗涤，加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤，加入终浓度为10 μg/mL的Hoechst染色液，染色5 min，PBS洗涤后，于荧光显微镜下观察并拍照，凋亡的细胞荧光更强，细胞核发白，呈现皱染。

1.3.3 EdU染色检测HL-60细胞增殖情况 将5×103个HL-60细胞接种到96孔板，用不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126处理HL-60细胞48 h，每孔加入终浓度为50 μM的EdU染液并孵育2 h，PBS洗涤3次；接着加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤，接着加入50 μL浓度为2 mg/mL的甘氨酸摇床孵育5 min，同时也可以加入100 μL的0.5%的TritonX-100进行渗透加强，PBS洗涤3次。紧接着每孔加入100 μL的1×Apollo染色液于室温避光反应30 min，PBS洗涤3次。每孔继续加入100 μL的Hoechst33342染色液，于室温避光反应30 min，PBS洗涤3次。最后于荧光显微镜下观察并拍照。EdU染色呈现红光，Hoechst染色呈现蓝光。

1.3.4 流式细胞术检测细胞周期 将8×103个HL-60细胞接种到6孔板，培养24 h后，用不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126处理HL-60细胞48 h，每组细胞首先收集1×105/mL个细胞，再加入5 μL的Rnase，吹打混匀后，37 ℃孵育1 h，再加入PI染液，吹打混匀并于室温避光孵育30 min，于1 h内在流式细胞仪进行细胞周期检测分析。

1.3.5 Western blot检测细胞中PCNA、Survivin、p21、p27及p-ERK1/2蛋白的表达 将8×103个HL-60细胞接种到6孔板，培养24 h后，用不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126处理HL-60细胞48 h，在冰浴条件下将6孔板中细胞刮下来，离心收集细胞，并加入细胞裂解液，裂解30 min，离心获得的上清液即是总蛋白。接着利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白煮沸10 min进行变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，后湿法转膜30～50 min。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗溶液（兔抗人PCNA，Survivin，p21，p27，GAPDH单克隆抗体，稀释度为1︰100；兔抗人ERK1/2，p-ERK1/2多克隆抗，稀释度为1︰200）孵育，4 ℃过夜；二抗溶液室温孵育1～2 h。于凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件统计各抗体条带灰度值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U0126对HL-60细胞活力的影响 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60细胞24、48、72 h后，经MTT实验发现，随着作用时间延长，细胞增殖抑制率显著提高（r=0.421，P<0.01），同时随着U0126浓度升高，细胞增殖抑制率显著提高（r=0.478，P<0.01）。且在48 h细胞活力适于后续实验研究，因此选择48 h作为后续实验时间。见表1。

2.2 U0126对HL-60细胞凋亡、细胞增殖及细胞周期的影响 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60细胞48 h，经Hoechst染色实验发现，5、10、20 μmol/L的U0126能使细胞核发白，皱染，说明细胞凋亡显著，见图1。0、5、10、20 μmol/L

的U0126作用HL-60细胞48 h，经EdU染色实验发现，与0 μmol/L比较，5、10、20 μmol/L的U0126能逐渐降低细胞增殖率（P<0.01），见图2和表2。0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60细胞48 h，经流式细胞术实验发现，与0 μmol/L比较，5、10、20 μmol/L的U0126能逐渐使细胞周期阻滞在G1期（P<0.01），见表2。

2.3 U0126对HL-60细胞中细胞周期及细胞凋亡相关蛋白表达的影响 0、5，10、20 μmol/L的U0126作用HL-60细胞48 h，与0 μmol/L比较，5、10、20 μmol/L的U0126能显著下调PCNA与Survivin表达，上调p21与p27表达，差异均有统计学意义（P<0.01），见图3和表3。

2.4 U0126对HL-60细胞中ERK1/2磷酸化水平的影响 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60细胞48 h，与0 μmol/L的（1.38±0.14）比较，5、10、20 μmol/L的U0126[（1.09±0.11），（0.72±0.70），（0.43±0.04）]均能显著下调p-ERK1/2表达，差异均有统计学意义（P<0.01），见图4。

3 讨论

MAPK信号通路是真核生物中一种保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路，参与了细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期等多种生理病理过程。MAPK通过三级酶促反应（MAPKKK-MAPKK-MAPK）将上游信号传递到细胞核中使得细胞产生相应的应答。Extracellular signal-regulated kanse（ERK）是MAPK信号通路关键成员之一，包括两个亚基ERK1和ERK2，外界刺激通过Ras-Raf-MEK通路将信号传递给ERK，ERK被磷酸化，进入细胞核，调控相关基因表达，影响细胞分裂、生长、增殖、凋亡、细胞周期等行为[3-4]。研究已经表明，ERK信号通路在白血病中高度激活，并与疾病的发生发展密切相关[8]。U0126是MAPK信号通路特异的、高效的、可逆的抑制剂，是ATP非竞争性的MEK抑制剂，不仅能够抑制活化的MEK1/2还能抑制未活化的MEK1/2，当U0126进入细胞内，能够特异性地结合于MEK上，改变MEK结构，进而遏制MEK活性，阻断MEK/ERK信号通路的传递[3-4]。研究已经表明U0126作为MAPK信号通路特异性抑制剂，能显著地抑制黑色素瘤细胞、肺癌细胞、舌鳞癌细胞、胶质瘤细胞增殖[5-7]，但U0126在急性白血病细胞中的作用机制尚未见报道，因此本课题组将对此展开研究。本研究首先利用不同浓度（5、10、20 μmol/L）的U0126作用急性白血病HL-60细胞24、48、72 h，MTT结果表明U0216能显著提高HL-60細胞增殖抑制率，具有时间及剂量依赖性。接着利用Hoechst染色和EdU染色进一步检测U0126对HL-60细胞形态及细胞增殖的影响，结果表明U0126能使HL-60细胞核发白、皱染，能显著降低细胞增殖率，进一步说明U0126对HL-60细胞增殖及凋亡具有显著的抑制或诱导作用，与U0126在其他肿瘤细胞中的效果一致[5-7]。

细胞周期的不可控制是肿瘤细胞无限增殖、凋亡受限制的重要原因，细胞周期主要调控点G1、S期，G2期也是众多抗肿瘤药物的主要作用靶点，特别是G1期，是决定着细胞是否能够进入S期，是否能够正常进行DNA复制、有丝分裂的前提[9-10]。所以本研究继续探讨U0126对HL-60细胞周期的影响，流式结果表明U0126能使细胞周期阻滞在G1期，能使细胞阻滞于DNA复制前期。细胞的增殖、凋亡受细胞凋亡相关蛋白、细胞周期蛋白调控。PCNA是一种发现于系统性红斑狼疮与细胞周期密切相关的蛋白，在G1期晚期表达量大大提升，在S期达到顶峰，同时能与细胞周期蛋白（CyclinD1），细胞周期依赖性激酶（CDKs）及p21形成四聚体参与细胞周期的调控[11]。Survivin是目前发现分子量最小的凋亡抑制因子，定位于17q25，主要表达于细胞周期的G2期。Survivin除了在胚胎组织外，在正常组织中几乎不表达，而在多种肿瘤组织中高表达，并与疾病的发展及预后密切相关，被认为是判断肿瘤发生和预后的有效标志物[12]。p21和p27是细胞周期依赖性激酶抑制剂的主要成员之一，p21能抑制CyclinD1与CDK4/CDK6的结合，阻滞细胞周期于G1期。p27能抑制CyclinD1/CDK2复合物的形成，从而也使细胞周期阻滞在G1期[13]。同时有研究表明肿瘤组织中ERK信号通路的激活与PCNA、Survivin、p21及p27的高表达或低表达密切相关，提示U0126可能可以通过调控上述蛋白表达影响HL-60细胞增殖与凋亡[14-15]。所以本研究利用Western blot检测U0126对HL-60细胞中PCNA、Survivin、p21及p27表达的影响，结果表明U0126能显著下调PCNA与Survivin表达，上调p21与p27，此结果正好与U0126使细胞周期阻滞于G1期一致。另外本研究继续利用Western blot检测U0126对HL-60细胞中ERK磷酸化水平的影响，结果表明U0126能显著的降低ERK1/2磷酸化水平。

综上所述，5、10、20 μmol/L的U0126能显著提高HL-60细胞增殖抑制率，具有时间及剂量依赖，同时U0126能使HL-60细胞核发白、皱染，降低细胞增殖率，使细胞周期阻滞于G1期，能显著下调PCNA与Survivin的表达，上调p21与p27，此过程与降低ERK1/2磷酸化水平有关。

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（收稿日期：2018-06-25） （本文编辑：程旭然）