黄 曙 范志宁 张 银

我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家，由于食管癌早期症状少、50%食管癌患者就诊时失去根治手术机会[1]，而且中晚期诊断及治疗后复发风险高，以致食管癌5年生存率仍相对较低[2]。随瘤体不断生长可致食管腔狭窄、堵塞，患者甚至不能进食、进水，生活质量极差[3-4]。食管支架因能迅速缓解食管狭窄和进食梗阻，有效解决食管气管瘘和食管纵膈瘘，改善患者生活质量和营养状况，成为晚期食管癌放、化疗外重要的综合治疗方式之一，在全世界广泛应用[1,5- 6]。但是，单纯的食管支架对肿瘤并无杀灭和抑制作用，只是姑息治疗。在置入术后不久，肿瘤可从支架间隙，或即使是带膜支架也会从支架两端突入腔内生长，再次阻塞食管[7]，肿瘤的生长和支架置入后再狭窄很大程度上约束了支架的应用，也限制了病人生活质量的进一步提高。研制兼具局部抗肿瘤作用的支架已成为食管癌支架研究领域的方向[7-8]。本研究在我们以镍钛记忆合金食管覆膜支架为骨架研制出载紫杉醇食管覆膜支架的基础上，进一步利用兔食管鳞癌模型对紫杉醇药物支架的疗效与安全性进行评价。

材料和方法

一、载紫杉醇食管覆膜支架的制备

载紫杉醇食管覆膜支架(紫杉醇药物支架)的制备由南京大学生命科学院生物医药技术国家重点实验室完成。简单描述其制备过程如下：以镍-钛记忆合金食管覆膜支架(常州佳森医用支架器械有限公司)为骨架，以紫杉醇为上载药物，将紫杉醇与聚氨酯共混，利用高压静电喷涂技术，实现支架表面的快速、均匀的覆膜及药物上载，制作紫杉醇涂层食管支架。经体外研究测试，10%载紫杉醇支架具有良好的释放性能，且生物稳定性、生物相容性以及内支撑作用等优良。我们选用规格为10 mm × 12 mm × 6 mm(直径)、紫杉醇上载量为 30 mg 聚氨酯—3 mg紫杉醇的支架用于进一步研究。

二、VX2兔食管癌移植瘤模型的制备

纯种新西兰大白兔(由南京医科大学实验动物中心提供)，体重2.0 ～ 2.5 kg，饲养于南京医科大学实验动物中心。

将VX2肿瘤细胞株(本室留存)于液氮中取出后按照快速复苏法进行复苏，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加PBS吹打后，重复离心5 min，弃上清后加入无血清DMEM培养液重悬，台盼蓝染色，活细胞计数，将悬液调制成1 × 106/mL活细胞浓度，用1 mL注射器按1 mL/只接种于兔后腿外侧皮下，3周左右可以触及实质性肿块。此时对荷瘤兔给予速眠新Ⅱ(0.2 mL/kg)肌肉注射麻醉，无菌下切去后腿皮下的实体瘤，迅速转移入超净工作台，再用无菌的PBS冲洗干净后剔除肿瘤组织表面的结缔组织，取肿瘤边缘生长旺盛的鱼肉样组织，用眼科剪剪碎。4片肿瘤碎片(每片体积约0.5 mm3)放入0.3 mL生理盐水中用于黏膜下注射。

新西兰大白兔禁食不禁水24 h后，速眠新Ⅱ(0.2 mL/kg)肌肉注射麻醉，置于左侧卧位。将超细胃镜(GIFXP260，奥林巴斯，日本)插入食管内，食管黏膜下注射约1 mL溶液(0.01%靛蓝胭脂红+ 0.01%肾上腺素+ 0.9%生理盐水)，然后将肿瘤碎片(4片肿瘤碎片放入0.3 mL生理盐水)注射到食管黏膜下层。禁食24 h后恢复日常饮食。80万U青霉素肌肉注射3 d。监测实验兔的食物摄入量和体重，观察食管腔狭窄情况。当内窥镜检查显示食管狭窄大于管腔2/3时，超声内镜测量肿瘤体积，并进行随机分组，分为普通金属支架组组与紫杉醇药物支架组。

三、支架置入

实验用兔麻醉。在X射线透视监视下，首先经口咽部放置导丝跨越狭窄进入胃。接下来，利用支架递送装置(常州佳森医用支架器械有限公司)在食管狭窄部位释放支架。术后内镜评估确认支架位置。

四、观察指标

观察两组支架置入后的近期和晚期并发症，包括瘘管、穿孔、出血、支架移位、食管再狭窄和手术相关死亡率等；监测实验兔的食物摄入量和体重。

支架植入后2周处死实验兔：动物腹腔注射戊巴比妥钠(35 mg/kg)，然后通过耳静脉注射20 mL空气。切除食管，将每个支架从食管中轻轻取出，再纵向切开食管。测量食管癌组织体积 V=长×宽×高/2。检查肝、肺、腹腔淋巴结转移情况。肿瘤组织进一步进行组织学检查。

五、统计方法

结 果

一、兔食管鳞癌模型的建立及随访情况

共22只新西兰兔接受内镜下食管鳞癌种植术，在内镜种植过程中有1只并发食管穿孔死亡。种瘤2 ～ 3周后，观察到19只食管腔内肿瘤形成且食管狭窄大于管腔2/3(图1A显示食管鳞癌移植瘤的内镜图像，图1B显示食管切开后的食管鳞癌移植瘤)。选择其中18只食管狭窄大于管腔2/3的荷瘤兔进行实验，随机分成两组，即普通镍钛记忆合金覆膜支架组(普通金属支架组)和紫杉醇药物支架组，各9只。通过支架输送器将支架置入病变部位，支架置入术后内镜图像如图2所示。支架置入2周内，普通金属支架组有2例(2/9)、紫杉醇药物支架组有1例(1/9)因肿瘤生长转移而死亡。支架置入2周后处死兔子时发现普通金属支架组有1例(1/9)、紫杉醇药物支架组有2例(2/9)出现支架移位。最终，普通金属支架组和紫杉醇药物支架组各6只荷瘤兔的数据被纳入统计分析。

A：内镜图像；B：食管切开后的实物图

图2 食管覆膜支架置入术后内镜图像

二、紫杉醇药物支架对食管鳞癌的疗效分析

支架置入前，利用超声内镜分别测量了两组移植瘤的大小，紫杉醇药物支架组为(0.317 ± 0.093)cm2，普通金属支架组为(0.362 ± 0.128)cm2，两组间无统计学差异(P> 0.05)。支架置入过程顺利，无出血、穿孔等并发症。支架置入2周后处死兔子，对纳入统计分析的各组6只实验兔进行紫杉醇药物支架的有效性评价。结果显示，紫杉醇药物支架组肿瘤体积为(0.721 ± 1.021)cm3，明显小于普通支架组为(6.507 ± 3.695)cm3，两组间有统计学差异 (P< 0.05)。此外，两组各出现肝、肺等远处转移2例。普通金属支架组体重丢失(0.395 ± 0.118)kg，紫杉醇药物支架组体重丢失(0.439 ± 0.163)kg，两组间无统计学差异(P> 0.05)，见表1。

表1 支架置入前后肿瘤大小与荷瘤兔体重丢失情况± s)

讨 论

近年来，食管支架(尤其是食管金属支架)作为食管癌重要的姑息治疗方法，已成为食管癌综合治疗方式之一，在全世界广泛应用[9]。但是目前的食管支架，只对食管起到支撑作用，缓解管腔狭窄，对食管肿瘤组织并无杀灭作用，限制了支架的应用。研制兼具局部抗肿瘤作用的支架已成为食管癌支架研究领域的方向[7-8]。因为我国食管癌的病理类型90%为鳞癌，而食管鳞癌对放疗敏感，有研究将放射粒子如125I捆绑于食管支架制成内照射支架[10-11]，取得一定疗效，但操作技术复杂，不能避免对环境的污染及对操作者和患者的辐射伤害，临床未能广泛应用。近年来，药物涂层支架在用于治疗恶性肿瘤的方法已引起人们的关注。2005年Lee等[12]首次报道了紫杉醇胆道金属支架对胆道恶性梗阻的治疗作用，我国学者王忠敏教授等[13-14]开展了载5-氟尿嘧啶(5-FU)消化道支架的研制及应用的系列研究工作，但是目前对抗肿瘤药物涂层支架的研究报道仍较少，仍处于起步阶段。

紫杉醇是近年来研发的新型抗肿瘤药物，具有良好的抗肿瘤活性[15]，对食管鳞癌的单药有效率达28%[16]。紫杉醇是脂溶性药物[17]，易透过细胞膜，能在短时间内到达较高的组织浓度，局部用药效果较顺铂、5-FU等水溶性药物更好；紫杉醇的亲脂性还与支架的被膜材料聚氨酯具有天然的高亲和力，聚氨酯在食管中的低亲水性可使紫杉醇长时间稳定释放，较水溶性药物更易达到长期缓释效果。另外，紫杉醇还具有抗良性狭窄作用，Jeon等[18]研究表明紫杉醇洗脱食管支架可减轻两端良性组织增生。因此，在前期的工作中，我们以镍钛记忆合金食管覆膜支架为骨架，研制出载紫杉醇食管覆膜支架，其药物释放性能良好，能够稳定有效释放达3个月，且同样具备原食管覆膜支架优良的生物稳定性、生物相容性以及内支撑作用等优点。本研究即是进一步利用兔食管鳞癌模型对载紫杉醇覆膜支架用于食管鳞癌治疗的疗效与安全性进行评价。

阻碍药物涂层食管支架研究的主要问题之一是缺乏合适的动物模型。食管癌模型大多是用大鼠等小型动物制作，但是由于大鼠的食管非常窄小，不能满足食管支架研究的需要。对于支架等方面研究，需要大型动物的食管癌模型。传统的化学致癌剂如ENNG诱发的犬食管癌模型，制作周期长，成瘤率低，成瘤部位不确定，除了可诱发食管癌外，还可诱发消化系统其他部位的肿瘤，不利于实验研究，目前已较少应用。近年来对兔食管癌模型的研究较多，技术也较成熟。VX2肿瘤细胞悬液注射法可在短时间内提供性质稳定、生长迅速的移植性兔食管癌模型，且成瘤率高，为理想的模型制作方法[19- 20]，因此本研究亦采用此肿瘤细胞悬液注射法制作VX2兔食管鳞癌模型，用于载紫杉醇覆膜食管支架的疗效研究。

在本研究结果显示，普通金属支架组与紫杉醇药物支架组间因肿瘤生长转移而死亡的例数无显著差别；支架置入2周后处死荷瘤兔时，支架完整率、肝肺等远处转移率及体重丢失程度两组间无显著差异，提示紫杉醇药物支架组安全性与普通金属支架组相似，未因支架上载紫杉醇而增加明显的毒副作用。支架置入2周后处死荷瘤兔时，发现紫杉醇药物支架组食管肿瘤的体积明显小于普通金属支架组，显示出紫杉醇药物支架局部抗肿瘤作用。

“载药食管支架”技术，即支架作为药物递送系统，在发挥支架支撑作用的同时，建立局部药物缓释系统，可满足靶部位长时间有效药物浓度。我们初步动物研究证明，载紫杉醇覆膜食管支架具有局部抗肿瘤作用，且安全性与普通金属支架组组相似，具有一定的应用前景。然而，因VX2兔食管鳞癌的进展较快，本研究最终纳入的实验例数较少，需要进一步扩大样本量深入研究。