张海霞， 赵克学， 邓盈盈， 梁浩勤， 李 倩， 韩玉梅， 马忠仁， 冯若飞

(1.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

跨膜蛋白43(Transmembrane protein 43)又称LUMA或TMEM43，在人体中主要由TMEM43基因编码[1].该蛋白包含4个跨膜结构域和一个大的亲水性结构域[2].该亲水性结构域位于内质网的腔内，并暴露于核周空间，而两端均位于细胞质或核质中，TMEM43的一小部分被保留在核膜层，是内核膜的完整膜蛋白[3]，可在内核膜上形成蛋白复合体来维持核包膜结构.

目前为止，对于TMEM43基因在心肌组织中的表达定位尚存在争议.相关研究表明TMEM43在心肌闰盘[4]、组织的肌纤维膜[5]、血液和心脏[6-7]，甚至心肌和骨骼肌在内的组织内等均有表达，且以单聚体、二聚体、三聚体、四聚体及寡聚体等不同形式存在[9-10].而Muchir等则认为该基因编码lamin蛋白，而该蛋白在核内参与DNA复制、染色质重塑以及核孔定位等过程[11-12]，因此该基因的突变可能会改变基因水平上的调控过程[13-14].

研究表明，与TMEM43相关的疾病主要有致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy， ARVC)和埃德型肌营养不良症(Emery-Dreifuss muscular dystrophy， EDMD)[2，15，16]，研究仅发现TMEM43基因相关位点的突变可引起ARVC[17-21]或EDMD[22].

但目前为止，针对TMEM43基因及其在组织内表达情况尚未进行深入研究，结构及功能认识十分有限，对其在机体内发挥的作用、不同组织内的表达含量及其作用等问题没有详实资料可解释.由此，对其突变引起的ARVC和EDMD研究仅限于疾病本身，且对TMEM43的表达情况定量检测尚属空白，Bengtsson和Otto在研究中也仅通过常规RT-PCR方法对不同组织内TMEM43 mRNA水平的含量进行了常规检测，并未定量[2].基于此，后期如果要对该基因进一步研究，就需要一种精准定量的检测方法作为研究基础.

本研究拟选择SYBR Green I染料建立一种简便、经济、且能精确定量TMEM43基因表达的检测方法[23-25]，以MRC-5细胞为材料，建立TMEM43 SYBR Green I real-time PCR方法，利用建立的方法检测不同组织内TMEM43 基因表达情况.根据TMEM43基因表达水平的不同，分析其主要分布位置.该研究为TMEM43 基因表达提供了检测手段，也为进一步研究TMEM43的结构及功能奠定基础，提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、幼年叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、牛肾细胞(MDBK)、犬肾细胞(MDCK)、猪肾细胞(PK15)、人星形神经胶质瘤细胞(u251)、人原发性肝癌细胞(PLC/PRF/5)、人胚肾细胞(HEK293)、人脐静脉内皮细胞(HuvEc)由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供.

1.1.2 主要试剂及仪器

胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；反转录试剂、Taq DNA聚合酶、总RNA提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司；SYBR Select Master Mix试剂盒购自美国ABI公司；Easy Pure Quick Gel Extraction Kit购自北京全式金生物技术有限公司；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit购自上海生工生物有限公司；PCR仪购自德国Biometra公司；实时荧光定量PCR仪(型号:7500)购自美国ABI公司；核酸蛋白快速检测仪(型号: BioPhotometer Plus)购自德国Eppendorf公司；凝胶成像系统购自美国GE公司.

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

参照Genbank公布的TMEM43基因序列(登录号NM_024334.2)，通过引物软件Primer Primer5.0和Oligo 6.0设计1对预期扩增目的片段为88 bp的特异性扩增引物(TMEM43-qF/R)，同时设计一条扩增TMEM43 CDS区全长目标序列为1 200 bp的TMEM43通用引物TMEM43-hF/R，并由大连宝生物合成(表1).

表1引物的核苷酸序列

1.2.2 标准阳性模板的制备

抽提MRC-5细胞总RNA(共60 μL)，取10 μL mRNA反转录为cDNA后作为模板，利用引物TMEM43-hF/R PCR扩增目的基因片段.25 μL反应体系：dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物TMEM43-hF/R (20 pmol/μL)各0.5 μL，cDNA模板 2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL， DEPC H2O 18.5 μL.反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共35个循环；72 ℃ 10 min.利用10.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物.

纯化PCR产物并连接至pMD18-T载体，筛选的阳性克隆进行测序鉴定.阳性质粒tongg核酸蛋白快速检测仪分别测定260 nm及280 nm处的OD值(吸光值)，计算液体中质粒的copies/μL.将该阳性质粒命名为TMEM43-Stand.

1.2.3 TMEM43 SYBR Green I 实时荧光定量PCR反应条件的优化

选用SYBR Green I染料法，加入SYBR Green I PCR引物，在ABI real-time PCR仪上进行反应，并根据计算机生成结果进行分析.25 μL总体系，遵循Ct值最小和荧光阈值最高原则，并确保溶解曲线无非特异性扩增产物，在此基础上分别优化最佳引物使用浓度及退火温度等条件.

1.2.4 标准曲线的制作

测定TMEM43-Stand质粒的OD260nm值，计算质粒浓度，以DEPC H2O 10倍倍比稀释成6个梯度(1.71×108～1.71×103copies/μL).作为模板，25 μL反应体系，利用优选条件，在ABI real-time PCR仪上进行反应.反应完毕，根据ABI real-time PCR仪软件自动计算出标准曲线.

1.2.5 灵敏性验证

将TMEM43-Stand质粒10倍倍比稀释，每个梯度各自为模板进行SYBR Green I real-time PCR反应(1.71×1010～1.71×10 copies/μL 10个梯度)以及普通PCR反应(1.71×1010～1.71×10 copies/μL 10个梯度)，以确定两种方法的检测下限.

1.2.6 重复性验证

选取1.71×1010～1.71×106copies/μL的重组质粒为样本，分别进行SYBR Green I real-time PCR反应，每个浓度3个重复，评价该方法的可重复性.

1.2.7 SYBR Green I实时荧光定量PCR的应用

选取5种不同组织的人源细胞及6种哺乳动物来源细胞，通过细胞计数各取6×105个细胞进行总RNA的提取及反转录.利用上述TMEM43 SYBR Green I real-time PCR方法对各细胞内TMEM43基因表达情况进行检测.

2 结果

2.1 质粒标准品的制备

从MRC-5细胞抽提的总RNA反转录成cDNA作为模板，用TMEM43 -hF/R引物进行PCR反应.电泳结果显示，目的基因大小符合预期(1 200 bp).PCR产物连接载体构建的克隆载体经PCR、双酶切及序列测定等验证，显示成功构建了质粒标准品(图1).该质粒命名为TMEM43-Stand.根据拷贝数计算公式：[6.02×1023×(ng/μL×10-9)]/(DNA length×660)=copies/μL，得出该质粒拷贝数为1.71×1011copies/μL.

图1 PCR产物及重组质粒的鉴定

2.2 TMEM43 SYBR Green I 实时荧光定量PCR反应条件的优化

优选的TMEM43 SYBR Green I real-time PCR 25 μL体系为：SYBR Select Master Mix (2×) 12.5 μL， DEPC H2O 9.7 μL，上、下游引物TMEM43-q F/R(10 pmol/μL)各0.4 μL，cDNA模板 2.0 μL.最佳反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，61.5 ℃ 35 s，共40个循环；95 ℃ 15 s；65 ℃至95 ℃，每0.5 ℃/s，10 s/cycle为间隔绘制溶解曲线.该条件下绘制的溶解曲线峰单一，表明扩增产物较好，无非特异性产物和引物二聚体(见图2).

图2 TMEM43 SYBR Green I荧光定量PCR扩增曲线(A)及溶解曲线(B)

2.3 标准曲线的制作

将TMEM43-Stand标准品10倍倍比稀释后，各浓度分别为模板进行SYBR Green I real-time PCR，得到动力学曲线(图3A)、溶解曲线(图3B)和标准曲线(图3C).初始模板浓度与Ct值线性关系较好，y=-3.502logx+42.853，扩增效率93.012%，相关系数R2=1.

图3 TMEM43 SYBR Green I荧光定量PCR动力学曲线(A)、溶解曲线 (B)及标准曲线(C)

2.4 灵敏性验证

以系列稀释的TMEM43-Stand标准品为模板，进行SYBR Green I real-time PCR及普通PCR检测，结果显示SYBR Green I real-time PCR检测下限为17.1 copies/μL(图4A)，而普通PCR检测下限为1.71×102copies/μL(图4B).表明，建立的SYBR Green I real-time PCR比普通PCR灵敏10倍.

图4 TMEM43 SYBR Green I 实时荧光定量PCR(A)与普通PCR(B)的灵敏性

2.5 重复性验证

经选取1.71×1010～1.71×106copies/μL的重组质粒为样本，重复3次进行SYBR Green I real-time PCR反应，结果显示，重复样本3条S型曲线之间的误差均小于1个循环(图5).表明建立的TMEM43 SYBR Green I real-time PCR方法具有较高的可重复性，从而可证明建立的方法可确保不同样品间结果的可靠性和稳定性.

图5 TMEM43 SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测方法的重复性

2.6 SYBR Green I实时荧光定量PCR的应用

通过对选取的MDCK、MDBK、PK15、BHK21、Vero及MRC-5等不同物种来源的哺乳动物细胞及u251、HuvEc、PLC/PRF/5、HEK293及MRC-5等人源细胞进行SYBR Green I real-time PCR方法对TMEM43基因表达情况的检测.结果显示，在该方法的检测范围内(检测下限为17.1个拷贝/μL).不同人源组织细胞中，仅MRC-5及HEK293细胞可检出TMEM43基因表达；而不同哺乳动物细胞中仅Vero细胞可检出(表2).

表2不同细胞中TMEM43表达量

3 讨论

通过该实验研究，成功建立了检测跨膜蛋白43(TMEM43)基因表达量的SYBR Green I real-time PCR方法，优选反应条件优化后进行方法的评价，结果显示，引物溶解曲线均为单峰，特异性好.该方法灵敏性较普通PCR高10倍且重复性较好.检测不同哺乳动物细胞中TMEM43表达量，显示TMEM43表达量在不同的哺乳动物细胞也有所不同，其中Vero表达量最高，MRC-5细胞及HEK293细胞次之，其余细胞未检出.该结果与Merner等研究结果相符合，表明TMEM43在不同物种不同组织中表达[7].

针对TMEM43的研究，目前涉及的较多的是其与致心律失常性右室心肌病(ARVD)相关的研究[15]，确定TMEM43基因为ARVD5的致病基因[7，16].但是目前，对于TMEM43的结构及功能知之甚少，进而对该基因的进一步研究受到限制；且对不同组织内TMEM43表达情况的检测研究更少.本实验首次成功建立了TMEM43 SYBR Green I real-time PCR检测方法.该方法选用简便、成本较低的染料法进行实验[25].本研究针对TMEM43 mRNA进行了实时荧光定量检测方法的建立.严格意义上来讲，应选用合成的RNA标准品来进行标准曲线的建立及检测.RNA标准品可信度较DNA质粒标准品高，但是因反转录效率不可能达到100%，实际操作过程越多误差就越大.考虑到临床样本检测的实际可操作性及经济因素，本研究最终选择制备的DNA质粒标准品进行方法建立及检测.最终结果显示，该方法中未出现非特异性扩增产物及引物二聚体，说明引物设计及条件优化良好.该方法能成功检出不同哺乳动物细胞中的TMEM43表达量，为今后临床样本中TMEM43基因表达情况的检测提供实验技术，也为进一步研究其生物学功能奠定实验基础.