*

1.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563006；2.成都中医药大学，四川 成都 610075

顺铂(Cisplatin，DDP)是目前临床上广泛应用于多种实体瘤的一线铂类抗肿瘤药物[1]。但随着顺铂剂量的增加，毒副作用亦增高，特别是肾毒性成为顺铂的剂量限制性[2]。因此，保留顺铂的抗癌作用，降低其肾毒性，是保证化疗效果的重要环节，也是多年来药理学、毒理学和临床治疗学等关注的热点。济生肾气丸原方出自南宋著名医家严用和的《济生方》[3]，由熟地、附子、肉桂、泽泻、茯苓等10味中药组成，有温补肾阳、化气利水、消肿止渴、纳气固本的功用。千百年来，该方在临床上多用于治疗由肾阳虚所致的多种疾病，如腰痛脚肿、小便不利、痰饮喘咳等。本课题组在前期研究工作基础上[4]，根据中医对顺铂肾损伤的认识，结合现代研究，提出益肾健脾，通络散瘀治疗顺铂肾损伤，最后拟定济生肾气丸加味组方。笔者研究用顺铂经腹腔注射制作大鼠急性肾损伤模型，通过观察大鼠肾脏系数、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肾组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等指标的变化，从氧化应激、炎症反应等方面探讨济生肾气丸加味对顺铂所致大鼠急性肾损伤的治疗作用及其机理，为临床用药和进一步筛选有效方药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠60只，雄性，8周龄，体重200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号：SCXK(京)2016-0011]提供。

1.1.2 药品与试剂 顺铂(齐鲁制药有限公司，批号：307026CF)；硫代硫酸钠(上海新亚药业有限公司，批号：H31020534)；济生肾气丸加味由熟地、附子、肉桂、黄芪、当归、丹参、三七、牛膝、车前子等组成，药物饮片购自北京同仁堂药店。参照传统水煎煮工艺，加工成煎剂，浓缩至相当于含生药4 g·mL-1，每次煎煮大鼠3 d的给药量，4 ℃冰箱保存备用；BUN试剂盒(批号：20170316)，Cr试剂盒(批号：20170311)，SOD试剂盒(批号：20170409)，MDA剂盒(批号：20170415)，购自南京建成生物工程研究所；大鼠TNF-α酶联免疫检测试剂盒(批号：1704121)，大鼠TGF-β1酶联免疫检测试剂盒(批号：1704121)，均为上海西唐生物科技有限公司进口分装产品。

1.1.3 主要仪器 酶标仪(DENLEY DRAGON Wellscan MK3型，美国Thermo公司)；洗板机(Wellwash 4 MK2型，美国Thermo公司)；紫外可见分光光度计(Cary50型，上海魁元科学仪器有限公司)；石蜡切片机(RM2235型，徕卡显微系统有限公司)；恒温烘箱(DHG-9023A型，上海恒一科学仪器有限公司)；离心机(L535-1型，湘仪离心机仪器有限公司)；正置显微镜(CX41型，日本Olympus公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 适应性喂养1周后，将60只Wistar大鼠随机分为以下6组：正常对照组(Ⅰ组)、模型对照组(Ⅱ组)、阳性对照组(Ⅲ组)、济生肾气丸加味低剂量治疗组(Ⅳ组)、济生肾气丸加味中剂量治疗组(Ⅴ组)、济生肾气丸加味高剂量治疗组(Ⅵ组)。根据文献报道[5]，结合课题组前期工作以及预实验，建立大鼠急性肾损伤模型。于实验第1天给模型对照组、阳性对照组、济生肾气丸加味低、中、高剂量治疗组大鼠一次性腹腔注射7 mg·kg-1顺铂造模，正常对照组腹腔注射同容积的生理盐水。腹腔注射顺铂后，济生肾气丸加味低、中、高剂量治疗组大鼠分别给予济生肾气丸加味水煎液10、20、40 g·kg-1灌胃，阳性对照组大鼠给予5%硫代硫酸钠(STS)70 mg·kg-1肌内注射，正常对照组、模型对照组给予同容积的生理盐水灌胃，1次/d。连续14 d。

1.2.2 取材 于实验第15天，将各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3500 r·min-1离心15 min，吸出血清，-20 ℃低温冰箱保存待测；采血后即刻摘取大鼠双侧肾脏，将左侧肾脏从肾门处纵切成两瓣，用10%中性甲醛溶液固定待测；取大鼠右侧肾脏组织0.2 g，加入PBS缓冲液，按照1∶9比例进行匀浆，3500 r·min-1离心15 min后吸出上清液，4 ℃冰箱保存待测。

1.2.3 指标的测定

1.2.3.1 一般状态观察 根据当前中医证候模型规范化研制成果[6]以及大鼠的生物学特性，主要观察并记录大鼠精神状态、活动情况、皮毛光泽度、摄食量、体质量、舌象、大小便等。

1.2.3.2 肾脏系数的测定 在麻醉状态下处死大鼠，取出双侧肾脏，剔除被膜及结缔组织后称重，并计算肾脏系数。肾脏系数(%)= 双侧肾脏重(g)/体质量(g)× 100%。

1.2.3.3 血清指标的测定 BUN测定采用二乙酰一肟法，Cr测定采用苦味酸法，SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA测定采用硫代巴比妥酸法，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3.4 肾组织中TNF-α、TGF-β1含量的测定 采用酶联免疫吸附测定法，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.3.5 肾组织病理学观察 取出已固定标本修块，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，于光学显微镜下观察大鼠肾小球、肾小管、基底膜等的病理形态学变化。

2 结果

2.1 对一般状态的影响 正常对照组大鼠精神状态良好，活动自如，皮毛白亮、光泽度好，摄食、饮水量正常，体质量增长平稳，舌质淡红，苔薄白。模型对照组大鼠精神萎靡，弓背蜷缩，喜扎堆，皮毛杂乱枯槁，摄食、饮水量减少，体质量逐渐减轻，大便稀软，小便清长，爪甲轻度紫绀，舌质淡嫩，舌面水滑。济生肾气丸加味各剂量治疗组大鼠的精神状态、活动情况、皮毛光泽度等优于模型对照组。

2.2 对肾脏系数的影响 各组大鼠经腹腔注射顺铂后，肾脏系数明显升高，与正常对照组比较，除济生肾气丸加味中剂量治疗组外，均有显著或极显著统计学差异(P<0.05，P<0.01)，提示顺铂造成了大鼠的肾脏损伤；而与模型对照组比较，济生肾气丸加味各剂量治疗组的肾脏系数均极显著降低(P<0.01)，提示联用济生肾气丸加味水煎液，对顺铂所致的大鼠肾损伤有治疗作用。如图1所示。

2.3 对血清BUN、Cr、SOD、MDA含量的影响 造模14 d后，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清BUN、Cr、MDA含量升高，血清SOD含量下降，有极显著性统计学差异(P<0.01)，表明顺铂诱发了大鼠氧化性损伤，并成功建立了大鼠急性肾损伤模型；而与模型对照组比较，济生肾气丸加味各剂量治疗组的血清BUN、Cr、MDA含量下降，血清SOD含量升高，有极显著统计学差异(P<0.01)，表明低、中、高剂量济生肾气丸加味水煎液可提高防御氧自由基损伤的能力，改善大鼠肾功能损害情况。见表1。

表1 各组大鼠血清BUN、Cr、SOD和MDA含量比较

注：与正常对照组(Ⅰ组)比较，#P﹤0.05，##P﹤0.01；与模型对照组(Ⅱ组)比较，▲P﹤0.05，▲▲P﹤0.01；与阳性对照组(Ⅲ组)比较，△P﹤0.05，△△P﹤0.01；与济生肾气丸加味低剂量治疗组(Ⅳ组)比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.4 对肾组织中TNF-α、TGF-β1含量的影响 模型对照组大鼠肾组织中TNF-α、TGF-β1含量上升，与正常对照组比较，有显著统计学差异(P<0.01)；济生肾气丸加味各剂量治疗组的TNF-α、TGF-β1含量低于模型对照组，均有显著或极显著统计学差异(P<0.05，P<0.01)。见表2。

组别TNF-α/pg·mL-1TGF-β1/pg·mL-1Ⅰ组1283±6131485±1025Ⅱ组3940±1370##3621±1478##Ⅲ组2324±742#▲▲2304±1001▲Ⅳ组2708±1362##▲▲2322±1399▲Ⅴ组2063±859▲▲2290±1364▲Ⅵ组1659±795▲▲∗2106±968▲▲

注：与正常对照组(Ⅰ组)比较，#P﹤0.05，##P﹤0.01；与模型对照组(Ⅱ组)比较，▲P﹤0.05，▲▲P﹤0.01。

2.5 对肾脏组织病理学的影响 光学显微镜下观察，正常对照组大鼠肾小球、肾小管结构清楚、正常，肾间质及肾小球无充血和炎细胞浸润；模型对照组大鼠肾小球囊腔增大，肾脏皮髓交界处呈现程度不等的肾小管扩张，肾小管上皮细胞变性、坏死脱落，肾小管基底膜裸露，肾小管腔内有大量红染物质，出现蛋白管型；济生肾气丸加味各剂量治疗组大鼠肾小球、肾小管、肾间质等病变，与模型对照组相比有明显不同程度好转。如图2所示。

3 讨论

顺铂所致肾损伤的发生机制是一个复杂的过程，包括细胞毒性、氧化应激损伤、炎症反应、细胞凋亡等多个方面[7]。血清BUN和Cr浓度可反映肾小球的滤过功能，肾脏系数变化可反映毒物对肾脏的综合毒性作用，故本研究以血清BUN、Cr和肾脏系数作为判断大鼠肾脏损伤程度的标志[8]。顺铂进入细胞后，一方面，产生大量自由基，造成线粒体氧化损伤，功能丧失；另一方面，通过直接或间接与谷胱甘肽(GSH)结合而引起细胞内GSH耗竭，同时还可抑制谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、SOD等的活力，使细胞内抗氧化能力减弱而引发氧化应激[9]。SOD是体内清除自由基的首要物质，可保护细胞不受氧自由基的损伤；MDA既是脂质过氧化的主要产物，又是继发损害的毒性产物，这两项指标的测定，可以反映氧化应激损伤的轻重程度。有研究表明，TNF-α在顺铂所致肾损伤中起到非常重要的作用，不仅参与炎症反应，还介导细胞凋亡；顺铂还可引起肾组织细胞纤维化，这也是其引起肾损伤的原因之一[10]。因此，本实验选用炎性细胞因子TNF-α和目前公认的最强致纤维化因子TGF-β1[11]，来判断大鼠肾脏炎症反应轻重和肾间质纤维化程度。

顺铂所致肾损伤，根据其临床表现，属中医“药毒”、“肾虚”、“水肿”等范畴。药毒留滞机体，损伤脾肾，水液输布障碍，清阳不升，浊阴不降，久则气血逆乱，脉络瘀阻。针对此病机，课题组选用济生肾气丸加味组方，以解化疗药顺铂所致的肾损伤。方中熟地滋补肾阴、填精益髓，加附子、肉桂之辛热，助命门之火以温阳化气，乃“阴中求阳”之治[12]；黄芪、白术益气健脾，促进脾胃运化和气机升降恢复；山茱萸、山药补脾肾而益精血；茯苓、泽泻、车前子利水渗湿泄浊；当归、丹参、三七、丹皮、川牛膝养血活血、通经散瘀。诸药相合，温而不燥，滋而不腻，助阳之弱以化水，滋阴之虚以生气，共奏益肾健脾、通络散瘀之效。

实验结果显示，1次性腹腔注射7 mg·kg-1顺铂的方法，成功建立了大鼠肾损伤动物模型。济生肾气丸加味能降低顺铂所致肾损伤模型大鼠的血清BUN、Cr、MDA水平，下调肾脏系数及肾组织中TNF-α、TGF-β1含量，提高血清SOD活力，改善肾脏组织病理学变化，且高剂量济生肾气丸加味治疗组效果尤佳，说明济生肾气丸加味水煎液可有效保护顺铂引起的肾损伤，其作用机制可能与济生肾气丸加味具有抗氧化作用，下调炎症细胞因子表达，减轻炎症反应，阻止巨噬细胞浸润到肾间质区，延缓间叶细胞转变和成纤维细胞发生纤维化。

综上所述，济生肾气丸加味可用于治疗顺铂所致的肾损伤，但有关该方的保护作用机理及临床应用还有待于进一步研究探讨。

[1]周金玲,杨玉芳,黄振光,等.三七总皂苷通过HIF-1α/BNIP3途径增强线粒体自噬保护大鼠顺铂肾损伤[J].中国药学杂志,2017,52(3):196-200.

[2]丁斗,董小君,王敏,等.尿β2-微球蛋白在顺铂所致肾毒性中的早期监控[J].甘肃中医学院学报,2013,30(2):5-7.

[3]李经纬,余瀛鳌,蔡景峰,等.中医大词典[M].2版.北京:人民卫生出版社,2006:1335.

[4]钱宁,董小君,郭科男,等.护肾Ⅰ号对顺铂致贵州小型猪肾损伤的预防作用及机制探讨[J].山东医药,2008,48(24):33-34.

[5]赵华叶,戚姝娅,李朝峰,等.艾迪注射液对顺铂所致大鼠肾毒性的保护作用研究[J].中国药学杂志,2016,51(22):1947-1952.

[6]秦川.实验动物学[M].北京:人民卫生出版社,2010:234-240.

[7]张启龙,聂克.顺铂致肾损伤中炎症介质作用机制的研究进展[J].山东医药,2016,56(11):90-92.

[8]连燕娜,高丽萍.益气补肾方药对顺铂致大鼠肾毒性及顺铂抗肿瘤活性的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2016,21(1):50-54.

[9]李贞,高丽萍.氧化应激在顺铂肾毒性中的作用[J].广东医学,2010,31(19):2600-2602．

[10]杨桂染,刘娜,胡艳华,等.加味黄连阿胶汤对顺铂肾毒性大鼠肾组织Ⅲ型胶原表达的影响[J].中医药导报,2013,19(9):13-15．

[11]董小君,丁斗,刘厚颖,等.加味苓桂术甘汤对肾纤维化大鼠肾组织TGF-β1表达的影响[J].中国民族民间医药,2016,25(12):53-54.

[12]李美珍,董小君,袁晓红.方剂学[M].北京:科学技术文献出版社,2015:130-131.