常海斌+侯占铭

摘要：现今世界上最热门的科学课题之一是生物体的基因功能研究。基因敲除（gene knockout）技术是研究基因功能最直接有效的一种遗传功能技术。该技术是科学家通过一定的方法使生物体内特定的基因缺失或失活的一种高科技技术。改变生物体的遗传基因，令特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，观察对生物体造成的影响，进而推测出这些基因的生物学功能。基因敲除技术主要是使用DNA同源重组原理，随着科学的进步和基因敲除技术的发展，除了同源重组以外，许多新的原理和技术也逐渐被采用，例如现今比较成功的基因敲除方法还有ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas技术等。笔者对基因敲除技术基本原理和其在各个方面的应用做了简要的介绍。

关键词：基因敲除；基因功能；ZFNs；TALENs；CRISPR/Cas

基因敲除技术在20世纪80年代后期快速发展，该技术是建立在胚胎干细胞技术和基因同源重组技术基础上的新型分子生物学技术。条件型基因敲除与完全基因敲除是基因敲除的两个分支。条件基因敲除是使靶基因在特定的发育阶段或细胞类型中完全丧失功能的科学技术。完全基因敲除是运用同源重组的方法彻底去除细胞中靶基因的活性，这种方法比较简单。美国遗传学家Mario R.Capecchi和Oliver Smithies以及英国遗传学家Martin J.Evans被授予2007年度諾贝尔生理学或医学奖，以此来嘉奖三位科学家在利用胚胎干细胞对小鼠进行特性基因修饰技术时的重大突破。为了提高基因敲除的特异性和效率，科学家们不断创新研究，发现了诸如ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas等许多基因高效靶向修饰和调控技术。这些在世界上新兴起的基因敲除技术为科研工作者对基因功能的研究提供了新的方法，使生命科学技术又向前迈进了一大步。

一、 基因敲除技术的主要方法

（一） 利用随机插入突变的方法

该方法的优点是敲除效率较高、可以使基因彻底失去活性及方便分离鉴别。从分类上来讲，随机插入突变可划分为转座子插入突变与TDNA插入突变。转座子插入突变仅适用于存在内源活性转位子的植物，但在实际中此类植物并不是很多。使用根癌农杆菌TDNA介导转化是TDNA插入失活技术的基本原理，即在基因组DNA上将一段拥有报告基因的DNA序列整合，这样产生的插入突变在植物基因组DNA中很稳定，插入位点的随机性也较强，但是植物只有容易被TDNA转化时此法才适用，而且易于产生染色体重排现象，使实验后续的遗传学实验变得艰难。现今该方法在拟南芥的研究中使用的较多。

（二） 利用同源重组的方法

使用DNA同源重组原理，用预先设计的同源片段代替靶基因片段，在受体细胞基因组与外源DNA中，发生同源重组的是序列一致或者相仿的基因，导致替换受体细胞基因组里的一致或相仿的序列，整合至受体细胞的基因组里。以此达到基因敲除的目的。该技术专一性强、整合位点精确，可以将外源基因导入基因组DNA的特定片段并使其稳定遗传。但是该方法的缺点是极其依靠细胞里自然出现的同源染色体随机互换，不过在自然情况下重组效率极低，并且实验重复性较差，需要很大的工作量才可以完成实验操作，况且单一地使用同源重组是无法永久修复人类基因组。

现今经过科学家的不断探索，人工核酸内切酶（Engineered endonuclease，EEN）技术的诞生令基因敲除更加容易，基因编辑的准确性与高效性以及实验的重复性都得到了大幅提高。EEN在特异性核酸序列介导下，对特异性DNA位点剪切的是核酸内切酶，形成双链断裂切口（double strand breaks，DSB），然后启动机体的DNA自我修复机制，对已经断裂的双链核酸进行修复。DSB修复机制包括非同源末端重组和同源重组两种形式。非同源末端重组是在对DSB末端简单加工后的直接连接，连接过程极易发生碱基的丢失和错配，最终结果是造成基因功能的丧失并实现基因的定点敲除。精确的基因靶向修饰技术能探索基因的功能，这对于了解病症的发生机制并确定治疗手段具有指导性意义。在多细胞生物尤其是在植物中，DSB的修复途径以非同源末端重组为主。现今在科学研究应用得较多的三种EEN主要有ZFNs和TALENs技术以及CRISPR/Cas系统。

（三） ZFNs

每个锌指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）单体在结构上都是由锌指蛋白（zincfinger protein，ZFP）和非特异核酸酶结合的人工合成酶。该酶N端部分可识别含有特定DNA序列的锌指蛋白，C端部分由非特异性切割结构域Fok I及连接DNA结合结构域和内切酶的肽段构成。ZFNs是将特异性识别模块和功能模块这2个有特定功能的结构域融合，达到形成具有特殊功能蛋白的目的。在ZFP结构域当中，最经典的结构类型是Cys2His2。ZFP结构域可以对核苷酸三联体进行特异性识别，因此将不同ZFP结构域有序地结合在一起，便可完成对一段核苷酸序列的靶向结合。

Fok I的C端的96个氨基酸残基可以组成DNA剪切域，而与锌指蛋白相连的非特异性核酸内切酶便来自于此，所以识别特定位点时是一个锌指蛋白组和Fok I单体连接形成一个ZFN。有活性的Fok I核酸内切酶是以二聚体形式存在的，因此ZFN也应以二聚体的形式发挥功能。2个单体ZFN在两个识别位点距离6～8bp时会相互作用产生酶切功能。1个DNA双链切口便在这个特异位点当中产生了，接下来进行切口修复的机制便是细胞的同源重组或非同源末端修复，便可达到定点精准修饰的目标。ZFN的特异性取决于锌指蛋白，所以筛选高质量的锌指蛋白才可以获得高效且有特异性的ZFN。

ZFNs是最早被广泛使用的基因组编辑技术，该技术的优点是技术平台很完善，可利用资源丰富，可针对特定序列设计ZFN以实现对靶基因的修饰。ZFNs可以精确地修饰基因以及其周围的调控元件，ZFNs技术极大地提高了基因敲除的效率，许多研究人类疾病的动物模型便是由该技术构建。但是ZFNs技术制备成本较高；而且脱靶率高，会导致切割基因组非特性序列，造成未知突变，导致后期鉴定工作量的增加；对目标DNA序列及其上下游序列依赖性高，因此设计高亲和性的ZFNs比较难；FNs在细胞中的表达最终还会产生细胞毒性。这些局限性在很大程度上降低了ZFNs设计与筛选的效率。endprint