郭豫杰　高会贞　李宏基　王月影　李奎　杨国宇

摘要：克隆猪的akirin2基因，并对该基因在猪的18个组织中的分布进行研究。猪akirin2基因编码区全长为612 bp（GenBank登录号KCl40110.1），推测的氨基酸序列包含203个氨基酸，为酸性蛋白。利用BLAST工具对克隆到的猪akirin2基因序列与人、大鼠、小鼠、绵羊和牛的序列进行同源性比较。采用软件对氨基酸序列进行分析，用相关序列的比对结果进行系统进化树分析。组织分布结果显示，猪akirin2基因在脑组织中高表达，在淋巴、睾丸中表达量相对较低，在心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺中几乎检测不到该基因的表达。序列分析结果显示，猪akirin2基因与绵羊和牛的同源性最高，均为96%，与人、小鼠、大鼠的同源性分别为95%、91%、89%。氨基酸序列分析发现，存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28，推测的氨基酸序列的二级结构中含有2个a-螺旋。在重建的系统进化树上，几个不同物种的akirin2蛋白分成3支，结果表明猪akirin2与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近，与鸡的亲缘关系最远。

关键词：猪；akirin2基因；克隆；组织分布；序列分析；基因功能

中图分类号：S828.2 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0025—04

在畜牧业中，肌肉的产量和质量是肉用畜禽的重要经济性状，对畜禽饲养业的经济效益起决定性作用。肌细胞的发育开始于成肌细胞或前体细胞。成肌细胞经过分化和融合过程形成肌管，其随后进一步分化成肌纤维。肌肉抑制素（my-ostatin，MSTN）（或生长分化因子8，GDF-8）是一种调节肌肉生长和发育的主要因子，MSTN表现出对肌肉生长的负调节。肌肉抑制素基因中11 bp的缺失在牛中导致比利时蓝（belgian blue）或双臀肌（double-muscled）表型，比利时蓝牛在肌肉质量上增加20%～30%。尽管在遗传分析中已经揭示出MSTN的重要功能，然而对MSTN信号通路下游调控肌肉发生的相关基因的了解还不多。akirin是Miner等通过小鼠消减抑制杂交文库筛选出的MSTN下游调控基因。这一新核蛋白基因的发现，填补了MSTN调控肌肉生成的上下游基因的空缺。在脊椎动物中akirin基因非常保守，至少存在akirin1和akirin2等2个同源基因。然而，在鸟类和爬行动物中没有akirin1，只有akirin2基因，在硬骨鱼中akirin基因家族有2～8个成员，在细菌、植物和酵母中均未发现有akirin的存在。张志强等首次克隆到猪的mighty（akirin1）基因，并对该基因在猪不同组织中的表达谱进行分析。本研究克隆猪的akirin2基因，并对其组织分布及序列特征进行分析，为进一步研究该基因的功能奠定基础。

1材料与方法

1.1样品采集

取健康猪的心、肝、脾、肺、肾、空肠、十二指肠、回肠、直肠、大脑、肌肉、皮肤、脂肪、胸腺、淋巴、下颌、子宫、睾丸等18个组织，用锡箔纸包好迅速冷冻于液氮中，置于-80℃低温冰箱保存备用。

1.2主要试剂与仪器

Trizol（Invitrogen）；DEPC（Serva）；Reverse TranscriptaseM-MLV（RNase H_）、RNase inhibitor、dNTP-mix、Premix TaqVersion 2.0、DL2000 DNA Marker、凝胶回收试剂盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）、pMDl9-T Vector均购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5ct菌株为笔者所在实验室保存。台式高速离心机（Eppendorf，Germany）；温度梯度PCR仪（sensoquest，Germa-ny）；凝胶成像系统（Alphalmager HP，USA）；微量核酸蛋白检测仪NanoDrop-100（Thermo，USA）。

1.3方法

1.3.1引物设计 根据NCBI上GenBank中小鼠和人的aki-rin2基因序列，在GenBank数据库中对猪的ESTs和UniGene数据库进行搜索，对搜索到的ESTs序列进行拼接，结合软件BIOXM2.6及引物设计软件，设计1对引物[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]：akirin2-F，5′-ATGGCGTGCG-GAGCTACTCTG-3′；akirin2-R，5′-TCATGAAACATAAC-TAGCAGGCTG-3′。

1.3.2总RNA的提取及cDNA的合成 取50～100 mg经液氮处理过的大脑组织，用Trizol法从中提取总RNA。取2μL样品，采用ND-1000分光光度计检测总RNA的浓度及纯度，取8μL进行甲醛变性胶电泳检测，其余总RNA样品-80℃冰箱中保存备用。反转录体系：0.5μg/μL Oligo（dT）₁₅1μL、总RNA 2μg、M-MLV Buffer（5×）5.0 IxL、10 mmol/LdNTP 6.0 txL、40 U/μL RNase-Inhibitor 0.7 txL、200 U/μLM-MLV Reverse Transcriptase 1.0μL、DEPC H₂O补足至25.0μL。反应程序：25℃10 min，42℃60 min，72℃15 min。反应结束后，迅速冰浴2 min，得到cDNA，置于-20℃保存。

1.3.3目的基因豬akirin2的扩增 以上述cDNA稀释5倍作为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系：Premix Taq聚合酶12.0 μL、10μmoL/μL akirin2-F 1.0 μL、10μmol/μLakirin2-R 1.0μL、cDNA 2.0 txL，用灭菌的蒸馏水补足至总体积为25.0μL，混匀，瞬时离心，立即置于PCR仪上。反应程序：95℃预变性5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，30个循环；72℃延伸15 min。反应结束后，取5μLPCR产物用

1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.4猪akirin2基因的克隆 PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行切胶纯化，产物纯化回收采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒进行。将回收的产物与pMD19-T载体直接进行连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α，涂布于含有50μg/mL Amp的LB平板上，37℃培养过夜。挑取3～5个单克隆作菌液PCR鉴定，经初步鉴定为阳性的克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.5组织分布 提取采集的猪心、肝、脾、肺、肾、空肠、十二指肠、回肠、直肠、大脑、肌肉、皮肤、脂肪、胸腺、淋巴、下颌、子宫、睾丸等18个组织的总RNA，经RT-PCR后得到相应的cDNA。选择猪的β-actin基因作为内参，引物序列：β-actin-F，5′-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3′；β-actin-R，5′-AGGAAGGAGGGCTGGAAGAG-3′，产物片段预计为138 bp。用于扩增猪akirin2基因的引物序列：akirin2-F2，5′-TCCATCAGCAACGTCCTCAC-3′；akirin2-R2，5′-AACTAGCAGGCTGTTCTCCA-3′，扩增片段预计为218 bp。各取5μLPCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，分析猪akirin2在以上各组织中的分布及表达情况。

1.3.6序列分析 利用ncbi在线分析服务器软件Blast（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行序列同源性比对。应用ExPASy（http：∥expasy.ch/tools/protparam.html）在线分析推测氨基酸序列的理化特征。信号肽序列的预测采用signalP 3.0在线软件（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/Signalp）。应用SABLE（http：∥sable.cchmc.org）在线软件对蛋白质的二级结构进行预测分析。

为了研究akirin基因在进化上的特点，选取NCBI中绵羊、牛、人、小鼠、大鼠以及鸡这几个物种的相关序列进行多序列比对，并用MEGA 5.0软件，选择邻接法（Neighbor-Join-ing）并自举（Bootstrap）1000次计算置信值，建立系统进化树。

2结果与分析

2.1总RNA的提取

肌肉组织总RNA采用Trizol法提取后，采用ND-1000分光光度计检测总RNA的浓度及纯度。D_260nm/D2_280nm为1.83，电泳条带以28S rRNA和18S rRNA为主（图1）。

2.2猪akirin2基因的克隆

总RNA经反转录后，以得到的cDNA为模板，经PCR扩增后，取5μL PCR产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示，扩增得到1个约为609 bp的片段（图2），该片段大小与预期目的基因大小位置接近。

2.3菌液PCR鉴定

经切胶纯化回收后，将该DNA片段与pMD19-T载体进行连接、转化、涂板及挑斑后，经菌液PCR对阳性克隆进行初步筛选，菌液PCR结果（图3）显示，在609 bp处有预期大小的目的条带。

2.4 RT-PCR分析猪akirin2基因组织表达谱

为了分析猪akirin2基因mRNA在不同组织中的表达及分布情况，本研究提取猪18个组织的总RNA，采用半定量RT-PCR的方法进行分析。目的基因猪akirin2的光密度值经内参基因β-actin进行修正，采用二者的比值作为目的基因的相对表达水平。结果显示，猪akirin2基因在猪不同组织中的表达和分布明显不同（图4），在有些组织如心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺等中几乎检测不到该基因的表达，在脑组织中该基因有相对较高的表达水平，在淋巴、睾丸等组织中可以检测到akirin2基因低水平的表达。

2.5序列分析

在GenBank中利用Blast工具对克隆到的猪akirin2基因进行同源性比较，猪akirin2基因与绵羊（Ovis aries，NM_001252176.1）和牛（Bos taurus，NM_001110087）的akirin2基因同源性最高，均为96%，与人（Homo sapiens，NM_018064.3）的同源性为95%，与小鼠（Mus musculus，NM_001007589.3）的同源性为91%，与大鼠（Rattus norvegicus，NM_001039914.2）的同源性为89%。从比对结果可知，该基因在不同物种间的同源性较高。

通过ExPASy软件在线分析预测到该蛋白质相对分子量为50 900.1，理论等电点为5.12，为酸性蛋白。采用signalP3.0在线预测信号肽软件分析发现，该多肽链序列无信号肽，不是分泌蛋白，序列分析发现存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28（图5），由此推测akirin2可能在细胞核中发挥功能，这在鼠和果蝇akirin2的研究中已经得到证实。

应用SABLE在线软件对猪Akirin2蛋白质的二级结构进行预测分析，结果显示，二级结构中含有2个α-螺旋（图6）。其中，靠近C-端的α-螺旋在猪、牛、羊、人、小鼠、大鼠及雞中都有。

为了研究akirin2基因在进化中的特点，选取NCBI中绵羊、牛、人、小鼠、大鼠以及鸡这几个物种的相关氨基酸序列进行多序列比对，并用MEGA 5.0软件，选择邻接法（Neighbor-Joining）并自举（Bootstrap）1000次计算置信值，建立系统进化树（图7）。在重建的系统进化树上，这几个不同物种的Akirin2蛋白分成3支，牛和羊先聚在一起，然后又与猪和人聚成其中一支，小鼠和大鼠聚成另外一支，鸡则单独在一支上。结果显示，猪Akirin2蛋白与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近，与鸡的亲缘关系最远。

3结论与讨论

目前已经报道了akirin基因在免疫、发育及肌肉再生等方面发挥了重要的生物学功能。本研究克隆了猪akirin2基因的编码区全序列，该序列包含612个核苷酸，由此推测编码203个氨基酸。人、牛、羊的akirin2基因的ORF的核苷酸序列也都是612 bp，编码203个氨基酸；小鼠和大鼠的akirin2基因的ORF包含609个核苷酸，编码201个氨基酸，鸡的akirin2基因的ORF仅有573 bp，编码191个氨基酸，比猪、牛、羊和人的少36 bp，共计12个氨基酸。大鼠和小鼠的akirn2连续缺少6 bp，氨基酸序列中连续缺少2个氨基酸残基，鸡连续缺失36 bp、12个氨基酸，缺失部分都不在α-螺旋区。由于氨基酸的缺失使得猪Akirin2氨基酸的序列同源性與大鼠和小鼠较近；而鸡Akirin2氨基酸残基缺失，导致猪与鸡的同源性最远，而氨基酸数目同样多的猪、牛、羊和人的同源性更近。人、牛、羊、大鼠、小鼠和鸡的Akirin2蛋白在其N-端都有一段保守的核定位信号序列，序列分析发现，猪Akirin2蛋白与其他物种的Akirin2蛋白一样，也含有1个核定位信号序列，这与报道的Akirin2是在细胞核中发挥功能的核蛋白相符合。此外，这一核定位信号序列在猪Akirin1蛋白中也能找到。应用SABLE在线软件对猪Akirin2蛋白质的二级结构进行预测分析，结果显示，猪Akirin2的二级结构中含有2个α-螺旋，靠近C-端的α-螺旋在猪、牛、羊、人、小鼠、大鼠及鸡中都有，该区域的保守性显示此区域可能对Aki-rin2发挥功能具有重要作用。

从猪akirin2基因组织分布的试验结果中可以看出，该基因在不同组织中的分布和表达水平明显不同。检测的18个组织中，心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺等组织中几乎检测不到该基因的mRNA表达，只在大脑中检测到相对较高的表达。Man等在研究不同日龄鸡的akirin2基因的组织表达谱时发现，在雏鸡和成年鸡16个组织中的akirin2基因表达存在差异，在3日龄鸡的11个组织肝脏、胸腺、肾脏、肌胃、心脏、皮肤、大脑、小肠、脾脏、肺和肌肉中该基因均有明显的表达，然而在成年鸡的某些组织如心脏、肝脏、大肠、腹脂和胰腺中则几乎检测不到该基因的表达，说明该基因的表达具有一定的时间特异性。该试验在雏鸡和成年鸡的大脑中都检测到了较高水平的akirin2 mRNA，这与本研究在猪的脑组织中检测到较高水平akirin2基因的表达结果一致。此外，猪akirinl（mighty）基因在脑中也显示有较高水平的表达。脑中akirin基因相对较高的表达水平具有的意义仍需要试验进行深入研究。与猪akirin1（mighty）基因在猪不同组织中的表达谱相比较发现，akirin1基因在各种组织中都有表达，而akirin2只在少数几个组织中检测到有表达，由于本研究没有检测蛋白水平的表达情况，导致猪akirin2基因表达差异的可能原因较多，由此推测猪akirin2在不同组织中的分布差异可能与该基因在不同组织中的功能有关。本研究成功克隆了猪的akirin2基因，并对其序列进行分析，检测猪akirin2基因在18个组织中的分布和表达情况，这些数据为进一步研究猪akirin2基因的功能奠定基础。