张宁 尹美强 谭青青

摘要：分析苦参转录组中的简单重复序列（SSR）位点信息，为开发分子标记奠定基础。利用Fastqc软件对苦参转录组测序的原始读长（reads）进行质量评估，再用Trimmomatic软件对reads质量较差的碱基进行过滤，利用Trinity软件对Trimmomatic处理后的reads进行序列组装，之后使用基因组装完整性评估（BUSCO）软件对转录组组装的序列進行质量评估，并分析组装的conting序列的开放阅读框（open reading frame，简称ORF）;利用MicroSAtellite（MISA）软件对无冗余独立基因（unigene）进行SSR搜索。利用Trinity软件最终筛选得到23074条ORF信息;使用MISA软件从unigenes序列中发现8 798个SSR位点，分布于7 339条unigene中，总体上unigenes序列中SSR占比为2.16%，SSR位点平均间隔是5.28 bp，其中占比最高的是单核苷重复基序，为50.53%;其次是出现频率分别为22.28%、24.73% 的二、三核苷酸。苦参转录组中SSR类型众多，出现频率高，在后续的苦参遗传性状分析，及次生代谢（苦参碱和黄酮等次生代谢产物）途径等相关基因定位等方面具有很好的应用潜力。

关键词：苦参;转录组;SSR;位点信息;基因功能;分子标记

中图分类号： R285  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0041-04

苦参（Sophora flavescens Ait.）是豆科槐属植物，以其干燥根入药，味苦，性寒，具有清热除燥湿、杀虫和利尿等药效。其主要药用成分是生物碱类和黄酮类化合物，已从苦参中分离出生物碱类39个，黄酮类122个成分[1]。苦参主产于山西、陕西、河南、河北等地，在医学临床、农业、畜牧业和日用品等中有广泛的应用[2]。气候的变化和人为过度的采挖造成野生苦参资源数量急剧减少[3]。因此，保护和利用好野生苦参资源是当务之急，势在必行。

分子标记开发可对制定合理有效的种质资源保护策略提供科学依据，但目前还缺乏能够应用于苦参种质鉴定、遗传图谱构建、功能基因定位等研究的简便、高效、稳定且具有种属特异性的分子标记体系。简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）是由核苷酸构成的重复序列，在真核生物和原核生物基因中都有存在。SSR 位点标记具有在生物中分布广泛、重复类型多样、出现频度高等特点[4]，主要应用于分子育种优良基因定位、生物多样性分析、遗传图谱绘制、突变体单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）位点分析辅助等。传统寻找基因组中SSR标记的方法存在位点开发成本高、步骤较多、操作繁琐等问题[5]。转录组SSR位点开发具有方便快捷、效率高等特点，且成本低廉。SSR开发引物能够直接快速地定位基因信息。随着苦参研究的深入，目前还未发现有关苦参转录组SSR开发的报道。本研究通过分析苦参转录组中的SSR位点信息，为苦参遗传性状分析、次生代谢（苦参碱和黄酮等次生代谢产物）途径、分子标记辅助育种及苦参遗传多样性研究提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 转录组数据来源

从NCBI（美国国家生物技术中心）数据共享平台获得苦参转录组数据，从SRA（Sequence Read Archive）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）获得苦参叶片RNA-Seq原始测序数据，下载编号是SAMD00029896，使用Illumina HiSeq1000对苦参组织进行建库测序，原始数据reads为 90 bp，采取双端（paired-end sequencing）测序，获得1.3 GB转录组数据，下载网址是ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov中的DRR031281[6]。

1.2 转录组的从头组装

首先通过Sratoolkit.2.8.2-1将sra格式转录组原始数据转换为fastq格式[7];使用Fastqc软件进行转录组原始数据质量评估，然后，利用Trimmomatic软件对fastq格式的序列进行低质量去除，leading头部去掉质量低于3的碱基，trailing尾部过滤掉质量低于3的碱基，每4个碱基是一个阅读框，4个连续碱基的平均质量低于15的过滤掉，reads中最小长度小于40序列的过滤掉 [8];随后，对高质量reads采用Trinity 软件进行从头（de novo）组装[9]，最短contig 长度设置为200 bp（参数为默认参数）。筛选每个基因最长的转录本作为unigene，最后组装得到苦参转录组的全部转录本（包含可变剪切）。

1.3 苦参转录组数据组装完整性评估

选取由Trinity软件组装的序列，使用BUSCO V 2.0.1软件进行苦参叶片转录组数据完整性评价[10]。BUSCO V 2.0.1 软件依据 Ortho DB 数据库，组成了几个大的进化分支单拷贝基因集，将转录本reads拼接结果与该基因集数据进行比较（基因集直接使用 HMMER3与参考数据库比对），依据比对上的比例、完整性评估拼接结果的准确性和完整性。

1.4 ORF预测

使用Trinity软件中的TransDecoder LongOrfs工具对unigene进行开放阅读框（open reading frame，简称ORF）预测，筛选大于100个氨基酸的ORF序列，获得最佳的ORF区域，使用Pfam （http：//pfam.xfam.org/）和UniProt（http：//www.uniprot.org）数据库对预测结果进行校正，将比对结果保留到Pfam和UniProt数据库的蛋白质序列中[11]。

1.5 SSR位点搜索

使用MISA软件[12]对苦参转录组数据unigene的SSR位点进行定位搜索，查询定位规则是三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复至少5次，二碱基重复不得少于6次，2个SSR位点之间不足100bp则视为复合型SSR。

1.6 含SSR序列的基因功能注释及生物碱基因挖掘

通过diamond blastx和diamond blastp分別将苦参中含SSR的8248条unigene序列与uniprot_sprot、Pfam和eggnog、Kegg、基因本体论（gene ontology，简称GO）等数据库进行比对，比对参数e值<10-5，然后利用WEGO（http：//wego.genomics.org.cn/）在线分析工具进行GO功能分类统计，分析含有SSR unigene的功能分布特征;通过与GO库进行比对后，得到的unigene注释结果按照GO数据库的23个类别进行分类统计。通过对WEGO注释结果（3个大类）23个子类更深入分析挖掘苦参碱相关基因，为进一步研究奠定基础。

2 结果与分析

2.1 苦参转录组de novo 组装

从NCBI数据库下载得到的苦参转录组测序（RNA-Seq）数据中共包含14 636 096个双端测序 reads，通过Trimmomatic软件过滤得到14 578 802 个高质量 reads。转录组 de novo组装获得53 179个长度大于200 bp的contigs，拼接获得的长序列（contigs）平均长度为813 bp，最长的 contig为22 546 bp，N50为1 464 bp;筛选每个基因中最长的转录本，共得到54 221条unigenes，平均长度为715.87 bp，最长的unigene 为12 122 bp，N50为1 464 bp（表1）。采用TransDecoder软件中LongOrfs功能进行ORF预测，筛选获得大于100个氨基酸的ORF有29 226个contigs;通过UniProt蛋白质数据库比对获得15 242条蛋白质序列，Pfam数据库比对获得126 429条蛋白质序列;使用TransDecoder最终筛选得到23 074条ORF信息。

contigs 和unigenes的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）占比都是44. 8%。从序列长度分布看，序列长度分布在1 000～2 899 bp 的序列大约有19.3%，≥2 900 bp的序列只有0.2%，600～999 bp的序列大约有13.6%，700bp 以下占71.4%（图1）。

2.2 转录组数据完整性评估

对转录组数据进行评估、测序、组装得到的转录序列覆盖所有可能的转录本。评估转录组数据的大小和完整性。依据植物直系同源基因数据集对苦参的转录组数据完整性进行评估，由表2可知，在由苦参转录组序列与植物基因组匹配获得的1440个植物单拷贝直系同源基因中，完全匹配到的直系同源基因（ complete）有1000个，占总BUSCO的69.4%，部分片段匹配对应到的单拷贝直系同源基因（ fragment）有171个，占总BUSCO的11.9%;没有匹配对应到的植物单拷贝直系同源基因（missing）有269个，占总BUSCO的18.7%，完全匹配到的单拷贝直系同源基因（complete）有973个，占总BUSCO的67.6%，完全匹配到的多拷贝直系同源基因（complete）有27个，占总BUSCO的1.9%。

2.4 转录组中SSR 位点的分布特点

使用 Trinity软件组装得到54 221条unigenes，碱基数为 38 815 308 bp，平均每条unigene长度为715.87 bp;使用 MISA软件搜索得到8 798个SSR位点，存在于7 339条unigenes转录组序列中，包括多个 SSR位点的 unigenes序列有1 173条（包含复合 SSR为551个）占SSR unigenes序列总数的13.33%。总体上unigenes序列中SSR占比为2.16%，SSR位点平均间隔距离是4 411 bp。其中占比最高的是单核苷重复基序，占总SSR 的50.53%;其次是出现频率分别为22.28%、24.73% 的二、三核苷酸。SSR最短平均分布距离是0.99 bp的单核苷酸重复类型，平均分布距离最长的是1.29 bp的五核苷酸重复类型。

苦参转录组不同重复类型的SSR位点都有多种基元，在考虑碱基互补且包含复合重复基元的情况下，重复类型合计93种，其中六核苷酸38种，五核苷酸22种，四核苷酸类型17种，在筛选的 SSR中单核酸重复优势基元为A/T，占比最高，为总基元类型的98.18%，其次是二核苷酸重复类型优势类型基元AG/CT，为65.72%。三核苷酸重复类型的优势基元是AAG/CTT，占比27.70%;四、五、六核苷酸重复类型的优势基元分别是AAAG/CTTT、AACAC/GTGTT、AGAGGG/CCCTCT，所占的比例分别是24.17%、11.90%、7.94%（表3）。

2.5 转录组SSR 基序重复类型和频率特征

不同重复类型苦参转录组SSR位点分布存在差异（表4）。单核苷酸重复类型设置重复数≥15次作为SSR位点的识别条件，因此在表中未分析单核苷酸类型。除单核苷酸外，各重复类型重复数在5～11次之间，随重复次数的逐渐增加，频率逐步降低。除单核苷酸外，5～7 次是主要集中次数，占SSR类型总数的大多数。

2.6 含SSR序列的基因功能注释及生物碱基因挖掘

为了解含有SSR序列苦参转录组序列的基因功能，本研究通过与公共蛋白数据库进行比对，得到含有SSR序列的分类信息和功能注释。结果发现，uniprot_sprot、Pfam、eggnog、Kegg、GO分别注释到3 094、3 162、3 061、3 138、3 467个基因。

GO注释将基因功能分为生物进程（biological process）、细胞组分（cellular component）、功能组分（molecular function）大类，其下又分了很多子类，从不同角度对基因的功能进行分类注释，各类间互相关联。GO注释可以全面描述苦参中SSR基因和基因产物的属性。将搜索到含有SSR的unigene序列使用blastx比对到蛋白数据库，取比对分值最高的为序列注释信息。细胞组分注释10312条，生物进程注释11 200条，功能组分注释4 376条。将含有SSR序列的3 467條unigene编号后与其对应的GO分类号一起导入到GO分类图形显示在线分析工具WEGO 软件中，得到其基因功能分布（图2）。结果表明，在3 467条unigene序列中注释信息获得23 483个功能注释，平均1条unigene有6.77个GO注释。

苦参主要药用成分是苦参碱和黄酮类物质，通过对含有SSR位点的序列进行GO注释数据挖掘，获得7个生物碱代谢途径相关基因，2个黄酮类生物合成过程相关基因。

3 讨论

苦参转录组 de novo组装获得51 606 个长度大于200 bp的contigs，使用uniprot和Pfam蛋白质数据库进行ORF比对校正，uniprot比对上15 242条蛋白质序列，Pfam数据库校比对上 126 429 条蛋白质序列，TransDecoder最终筛选得到 23 074条ORF信息，unigenes序列长度在700 bp 以下的序列

数大约占总序列数的70%。BUSCO对转录组组装结果：C占比为69.5%，S占比为67.6%，D占比为1.9%，F占比为11.9%，M占比为18.6%，总BUSCOs数目为1 440条。

苦参转录组序列通过MISA搜索到8 798个SSR位点，SSR位点的unigenes序列在苦参转组序列中SSR位点占比为2.16%，平均分布距离4 411 bp出现1个SSR。与其他药用植物比较，高于党参的0.022%[13]，低于丹参的0.047%[14]，高于西洋参的0.013 3%[15]和人参的0.017 2%[16];与豆科模式植物大豆相比，高于大豆的0.013 5%[17]。表明苦参的SSR位点数量较为丰富。通过对含有SSR位点序列的注释进一步分析获得苦参生物碱相关代谢基因，为后续相关研究提供参考。

本研究结果为苦参转录组数据中的SSR位点分析提供依据。本研究对转录组序列进行了ORF预测，反映了基因组中基因的编码区域，可进一步确定基因位置，省去了SSR引物设计开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用了生物信息数据库现有测序数据，降低了开发成本。同时也明确了苦参SSR位点的基本特点，为进一步开发设计新的苦参功能基因SSR 标记奠定了基础。苦参中SSR对于苦参基因功能资源的开发利用、遗传资源评估、丰富的分子标记、种质资源改良和比较基因组学研究都具有重要的价值。

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